제시 작품 SNF Ambizione 친교 (PZ00P2_142533)와 Velux 연구 그랜트 (Amplebig)에 의해 지원 되었다. 우리는 실험적인 작품에 대 한 베티 바그너를 감사 하 고 싶습니다.

1. 생태계 선택 및 Biofilm 샘플링
<ol><li>관심의 수생 생태계를 선택 하 고 샘플링 사이트 biofilms 성장. 얕은 부분으로 스트림의 중간 물 흐름을 느리게 그리고 돌 streambed biofilm 첨부 파일에 대 한 적절 한17,18.</li>
	<li>옵션: 없으면 사이트 충분 한 표면에 biofilm 첨부 파일에 대 한 또는 사이트 내에서 biofilms 가변성을 감소, biofilm 첨부 파일 (예: 유리 슬라이드, 세라믹 타일)에 대 한 인공 기판에 배치 사이트 있는지 하는 동안 그들은 물의 흐름에 관하여와 비슷한 깊이 빛의 강도19에서 같은 방향으로 배치 됩니다.</li>
	<li>샘플링 사이트, 빛의 강도 측정을 사용 하 여 휴대용 기기에서 환경 조건을 확인 하려면 물 온도, 전도도, 산소와 pH 표면 biofilm 바로 위에 샘플링입니다. 샘플링의 과정을 통해 조치를 반복 (3-5) 평균값을 계산 하려면.</li>
	<li>선택 사항: 관련 확인 받아 물 샘플 물 화학 매개 변수 (녹은 유기 탄소 (DOC), K+Na+, 캘리포니아2 +, 마그네슘2 +, Cl-, F-, SO42-, PO42- , 아니32-, SiO44-).</li>
	<li>보호 장갑에 사용 하 여, 각 사이트 (또는 인공 기판)에서 유사한 돌 (크기, 모양, 및 형식)를 수집 합니다. 돌 비슷한 흐름을 조명 조건18노출 되어야 합니다.</li>
	<li>것 (예를 들어, 샘플 당 15 mL) 모든 수집 된 샘플에 대 한 준비 사이트에서 충분 한 스트림 물의 0.22 μ m 필터를 통해 필터링.</li>
	<li>부드러운 칫 솔을 사용 하 여 필터링 된 스트림 물20의 15 mL로 플라스 크 (브러쉬 모든 biofilm 제거 될 때까지)에 biofilm 기판에서 제거.</li>
	<li>0.01 %paraformaldehyde 및 0.1% 글21에 샘플을 수정.</li>
</ol>2. 최적의 흐름-cytometric (FC) 매개 변수 결정
<ol><li>가벼운 현미경을 하위 전송 (40 / 0.75 X를 사용 하 여 목표; 필요한 100 × 1.3 오일 목표를 사용 하 여) 종 샘플22,23에 확인.</li>
	<li>주문 확인 적절 한 문화 컬렉션에서 단일 종 (예: 실험 조류학 및 Goettingen의 대학 [EPSAG]에 조류의 문화 컬렉션 또는 [CCAC] 쾰른 대학에서 문화 조류 컬렉션의 경우 모니터링 수행 됩니다 중앙 유럽 생태계에).</li>
	<li>Biofilm 샘플에서 찍은 환경에 단일 종 비슷한 환경 조건 (예: 빛, 온도, pH)에서 지속적으로 성장. 1 ° C와 0.5 내 환경 샘플에서 pH 포인트는 것이 좋습니다.</li>
	<li>분리/분산 셀, 원심 분리기 튜브 단일 종 샘플의 15 mL를 넣고 하 고 물 욕조의 센터에 튜브를 넣어 잠수함, 그 샘플의 액체 표면 목욕의 표면으로 동일한 수준. 45 kHz24,25에서 1 분 샘플 sonicate</li>
	<li>플레이트 리더를 사용 하 여 단일 종의 흡 광도 및 형광 스펙트럼을 기록 합니다. 지침에 대 한 선택의 플레이트 리더를 참조 하십시오. 이 예제에서는에서 96 잘 플랫 바닥 투명 polystyrol 접시 200 µ L 샘플 볼륨으로 로드 하 고 흡 광도 측정 했다. (사용 되는 설정: (a) 형광 스캔 모드; 방출 파장 단계 10 nm, 방출 스캔 번호 30, 대역폭 20 nm 크기, 100, 25 섬광, 20 미국 통합 시간 또는 흡 광도 (b) 스캔 모드; 25 섬광, 대역폭 9 nm).</li>
	<li>레이저, dichroic 스플리터와 필터를 조합에 다른 종 특정 속성을가지고 있는 모든 그 형광 범위를 커버 흐름 cytometer를 설정 합니다. 중앙 유럽 스트림에서 405 nm, 488 nm 및 638 nm 레이저 유용한 결과 얻을.</li>
	<li>Photomultipliers (모든 교류 cytometers은 적용 되지 않음)의 전압 설정 및 측정된 fluorescences의 범위는 샘플의 모든 이벤트의 99% 이상 포함 하도록 조정 합니다.</li>
	<li>또는, 종은 biofilms에 존재에 대 한 지식을 사용할 수 있는 경우 단계 2.2 시작. 형광 속성 알고 있는 단계 2.6 시작 합니다.</li>
</ol>3. 선택 사항: 흐름 cytometric 참조 데이터베이스 준비
참고: FC는 biofilm에 셀의 분류학 id를 허용 하지 않습니다. Biofilms로 유사한 조건에서 성장 된 biofilms에 존재 알려진 단일 종의 FC 측정 참조 데이터베이스는 데이터의 해석으로 도울 수 있다.
<ol><li>
참고: 단일 종
	<ol>
<li>2.5-7에 최적화 된 FC 매개 변수를 사용 하 여, 단일 종 (paraformaldehyde에도 고정 및 교류 cytometer에 대 한 적절 한 크기의 필터를 통해 필터링)의 광학 속성과 형광을 측정.</li>
		<li>같은 방식으로 데이터 (단계 6.1.2 참조) biofilms에서 단일 종에서 데이터를 정상화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
참조: 손상 되 고 부패 셀 Biofilm 건강의 가장 중요 한 지표 중 하나는 biofilm에 손상/죽어가는 세포의 일부분입니다. 이러한 셀을 계량, 부패 셀의 참조를 준비 수 있습니다.<ol>
<li>1 mL 희석된 biofilms의 샘플이 고 탁상 원심 분리기에서 10 분 동안 그들을 실 온에서 8000 x g 에서 원심. 1 mL 90% 에탄올에 결과 펠 릿을 일시 중단 하 고 4 ° c.에 하룻밤 정지를 저장 다음날에 반복 합니다.</li>
		<li>최적화 된 FC 설정을 사용 하 여, 손상 되 고 부패 셀 (고정 및 필터링)의 광학 속성과 형광 측정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
참고: microplastics 참고:: 는 biofilms에 microplastic 입자 모니터링에 관심이, 그들은 충분히 다른 지 여부를 확인 광학에 생물 입자 및 식별에 대 한 형광 속성에서.<ol>
<li>Microplastics 프로듀서의 지시에 따라 microplastic 입자를 일시 중단 하 고 (2.7에서 FC 매개 변수를 사용 하 여) 그들의 광학 및 형광 속성을 측정 한다.</li>
		<li>Biofilm 샘플을 microplastic 입자를 추가 하 고 위에 밤에 4 ° c.</li>
		<li>펜션과 같은 FC 매개 변수로 위의 측정값을 필터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 샘플 준비와 저장
<ol><li>FC 설정 이며 FC 참조 데이터베이스 준비, 일단 하나 1.1-7 단계에 따라 수집 된 신선한 biofilm 샘플의 평가 함께 진행할 수 있습니다. 분리/분산 된 biofilm, 원심 분리기 튜브 샘플의 15 mL 플라스 크 (단계 1.7 참조)에서 전송.</li>
	<li>물 목욕의 센터에 각 튜브를 넣고는 샘플의 액체 표면 목욕의 표면으로 동일한 수준에 잠수함. 1 분 45 khz 샘플 sonicate</li>
	<li>0.01 %paraformaldehyde 및 0.1% 글 (nanopure 물에 재고)에서 샘플을 수정. 분석에 대 한 준비까지 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>중요:-cytometry 분석에 대 한 샘플의 절반을 사용 하 고 절반 형광 활성화 된 세포 분류 또는 가벼운 현미경 검사 법 (제 6 항 참조) 선택적 유효성 검사에 대 한 스토리지 안전에 대 한 유지. :: 을 참고 냉장고에 저장, 고정된 biofilm 샘플 유지 한다 그들의 광학 및 형광 속성 3 주 최대.</li>
</ol>5. FC를 통해 샘플을 실행합니다.
<ol><li>샘플은 냉장고에 저장, 신속 하 게 그들을 sonicate 또는 여러 번 입자를 분리 하기 위하여 플라스틱. 측정 하기 전에 50 μ m 필터 (필터 크기는 FC 모 세관의 너비에 따라 달라 집니다)는 하위를 필터링 합니다.</li>
	<li>개별 샘플을 로드 (1-2 mL,이에 따라 달라 집니다 사용 교류 cytometer) 교류 cytometer로 각 입자의 광학 및 형광 특성을 측정 하 고. 각 생물 복제 (3 기술 복제) 당 3 회 측정을 반복 합니다.</li>
	<li>FC.csv 형식에서에서 데이터를 내보냅니다.</li>
</ol>6. 데이터 준비 및 상관 관계 분석
FC 각 측정된 광학 속성 및 형광 범위에 대 한 여러 매개 변수 (예를 들면, 신호 면적, 높이, 너비) 분석할 수 있습니다. 측정된 변수에 상관 관계 분석을 실행 하 고만 높은 상관 없습니다 그 측정을 유지. 이 보통 한 FC 매개 변수 (예를 들면, 신호 지역) 제외 하 고 모두 제거 하 고 상관 수 있다 또한 제거 높은 형광 측정 (일반적으로 동일한 레이저에서 형태소 및 필터 인접).
<ol><li>
Matlab에서 도구 상자 CYT 실행:
	<ol>
<li>CYT 소프트웨어16, 모든 기술 등 생물 학적으로 분석 하는 모든 샘플에서.csv 형식에서 가져오기 감소 FC 데이터 복제 합니다. (클릭 +, 파일 필터 *.csv 가져오기 파일을 선택).</li>
		<li>하이퍼볼릭 아크사인 변환을 사용 하 여 모든 샘플의 형광 채널 변환. 공동 인자 값; 선택할 필요가 150 일 가장 광합성 biofilms 및 교류 cytometers 하지만 최적화에 대 한 특정 실험 설정 및 이렇게 biofilms에 대 한 필요할 수 있습니다. (오른쪽-클릭/변환/입력 cofactor 150)</li>
		<li>품질 관리에 대 한 시각 비교 (CYT)에서 개별 샘플 및 확인 거기 아무 outliers 복제 기술 및 생물 학적 수준에서 개별 광과 형광 채널의 히스토그램. Outliers는 복제 사이 크게 이동한 형광/광학 배포판에서 매니 페스트 것입니다. (데이터, 선택 채널, 플롯을 선택)<ol>
<li>대안: 형광 배포판의 중간 값에 주성분 분석 (PCA)를 실행 하 고 기술 및 생물 복제 클러스터 함께 있는지 확인 하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>기술 각 생물 복제에 복제 병합 및 subsample 생물학 복제, 각각 입자 (셀, 셀 조각 및 abiotic 입자)의 동일한 수로 표시 되 고 입자의 총 수에 의해 분석 반 즈-헛 확률적 이웃 (bh-SNE) 포함 (최고의 시각화 결과26)에 대 한 약 150, 000 이다. (데이터, 마우스 오른쪽 단추로 클릭, 병합/Subsample 선택)</li>
		<li>샘플 사이의 비교에 대 한 그것은 비교 하는 샘플만을 선택 하는 것이 중요입니다. 샘플을 선택 하 고 bh SNE27실행. 알고리즘 완료, 새로운 채널은, 일단 명명 된 bh SNE1와 bh SNE2 나타납니다. 이들은 점도 (viSNE 지도)에서 데이터를 시각화 하는 데 사용할 수 있습니다 모든 분석 된 입자의 SNE 좌표. (데이터, 채널, 마우스 오른쪽 단추로 클릭, bh SNE, 정규화 된 데이터 예)</li>
		<li>ViSNE 지도에서 입자는 유사성에 따라 배치 하 고 시각적으로 분리 클러스터로 그룹화 합니다. CYT에서 사용할 수 있는 그리기 도구를 사용 하 여 다른 광/형광 속성 있고 잘 분리 되어 그의 클러스터와 마크와 이름 광/형광 속성 검사 합니다. (선택 채널 bh-SNE1, bh-SNE2)</li>
		<li>옵션: 하나의 미생물 종 (같은-cytometry 설정 측정 및 유사한 조건 하에서 성장!)의 참조 데이터베이스를 사용할 수 있으면 viSNE 지도 Matlab으로 내보내고 지도에 참조 데이터베이스 프로젝트. 이 방법에서는, 특정 클러스터 특정 종/분류학 그룹 (https://github.com/anzezupanic/FC_analysis에서 다운로드에 사용할 수 있는 스크립트)에 연결할 수 있습니다. (세션/저장)</li>
		<li>문제 해결: bh SNE 분석은 시각적으로 분리 클러스터, 하지만 하나의 큰 하나를 반환 하지 않으면, 너무 많은 입자에서에서 사용 되었다 bh SNE. 샘플 당 적은 입자와 다시를 시도 하십시오. 클러스터, 하지만 오히려 스파스 개별 포인트 경우 사용 하는 입자의 수를 늘립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>선택 사항: bh-SNE는 클러스터링에 사용 하는 대신 다른 클러스터링 방법 (예를 들어계층 구조, 중심 기반 또는 밀도 기반 클러스터링) 정규화 된 데이터에 사용 하 고 수 다음 viSNE (https://github.com/에 겹쳐 anzezupanic/FC_analysis)입니다.</li>
	<li>클러스터 확인 한 후, 각 샘플에 각 생물 복제에 속한 각 클러스터에 있는 입자의 수를 계산 합니다. 적절 한 (예를 들어, 홈즈)와 ANOVA와 Tukey의 테스트를 사용 하 여 샘플 간의 차이 평가 여러 비교에 대 한 수정.</li>
</ol>7. 선택 사항: 유효성 검사 형광 활성화 된 세포 분류를 사용 하 여 클러스터 해석의
<ol><li>클러스터 확인 한 후, 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 사용 하 여는 FACS 구성이 비슷한 (또는 동일한) 레이저 및 형광 필터는 원하는 경우 샘플에서 그들을 정렬.</li>
	<li>식별 된 각 클러스터 CYT 광과 형광 게이츠를 클러스터를 정의 하는 제공 합니다. 이 게이트를 사용 하 여 각 클러스터는 FACS에 입자를 밖으로 정렬 한 다음 가벼운 현미경 검사 법을 사용 하 여 정렬된 셀을 식별.</li>
</ol>

<ol>
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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+detachment+procedures+for+direct+counts+of+bacteria+associated+with+sediment+particles,+plant+litter+and+epiphytic+biofilms.">Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms.</a> Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Data+using+t-SNE.">Visualizing Data using t-SNE.</a> J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).</li><li>van der Maaten, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+t-SNE+using+Tree-Based+Algorithms.">Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms.</a> J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

위에서 설명한 프로토콜은 구현 하려면 상대적으로 간단 합니다. 그러나, 표시 기본 설정을 모든 광합성 biofilm 지금까지 테스트에 적합 하도록 표시 되었습니다, 하는 동안 최적화 (프로토콜에서 설명) 하는 대로 방법에서 얻은 정보를 최대화 하기 위해 필요 하다. 실제로, biofilms의 광과 형광 속성 환경 조건 (계절, 온도, 물의 화학 성분)1에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서,이 가...

Biofilms는 미생물 및 생태계의 생물 다양성의 분포에 영향을 미치는 주요 생산, 영양소 사이클링, 및 물 정화에서 이르는 민물 생태계에서 중요 한 역할을 하는 미생물의 동적 컨소시엄 1. biofilms는 변화 하는 환경 조건 또는 화학 물질, 같은 스트레스에 노출 되 면 그들의 지역 사회 구조 신속 하 게 더 관대 종2,3쪽으로 이동. 그러나 그들의 높은 감도 현재 방법의 아무도 완벽 하 게 실제로 biofilm 커뮤니티의 동적을 추적 하는 빠르고 쉬운 방법에 적합 한 biofilms 환경 모니터링4, 매력적인 모델 시스템으로 변합니다.
기능과 구조 끝점의 측정 biofilms 하 방법의 일반적으로 사용 되 세트에 의하여 이루어져 있다. 전체 사회의 수준에서 광합성 및 호흡 활동 뿐만 아니라 세포 외 효소의 활동 정보를 제공 합니다 biofilm5,6,7,8의 기능 상태에 ,9. 바이오 매스 계산 전체 biofilm 성장 표시기로 사용 됩니다. 구조적인 변화는 현재 가벼운 현미경 검사 법 또는 뉴클레오티드 기반 기술 (예를 들어, 그라데이션 젤 전기 이동 법 (DGGE), 자동화 된 ribosomal intergenic 스페이서를 변성 시키기 전통적인 종 식별을 사용 하 여 측정 분석 (아리사) metagenomics)10,,1112. 이러한 방법 정보를 제공 하지만 수행, 또는 특정 지식이 필요로 수 있습니다 또는 아직 개발 중인. 마지막으로, 세포 외 고분자 물질 (EPS)13,14 와 biofilm 건축1을 민감한, 동안 평가 대 한 새로운 방법을 낮은 처리량 고 쪽으로 아직 개발 하지 않은 목적을 모니터링합니다.
민물 biofilms의 완전 한 특성, 그것은 biofilm 기능, 구성 및 아키텍처에 대 한 통찰력을 제공 하는 여러 가지 다른 방법을 결합 하는 데 필요한 것이 분명 하다. 환경 모니터링, 다른 한편으로는 biofilm에서 변화를 감지 하 여 설정 기능 및 구조적 수준에서 교대의 기본적인 생물 학적 해석 수 있는 신속 하 고 중요 한 방법이 필요 합니다.
우리 스트림 biofilms (periphyton), 목적, 모니터링을 위한 충분히 빠른 이며 동시에 biofilm 커뮤니티에 충분 한 정보를 제공 한다 광합성의 미생물 지역 사회 특성에 대 한 새로운 방법을 개발 했습니다. 생물 학적 해석15수 있도록 구조입니다. 그것은 단일 셀 cytometry (FC) biofilm 샘플에 기반 하 고 전산 시각화 함께 단일 셀 수준에 biofilm의 광과 형광 속성에 정보를 제공 합니다.
Biofilm 샘플링 후 워크플로 샘플 준비 쥡니다, 고정, cytometry에 의해 샘플을 평가 하 여 다음 샘플의 크기 기반 필터링의 형태로 이루어져 있다. 단일 측정에 여러 세포 특성에 정보를 제공 하는 인수 데이터: 입자 크기, 밀도, 안료 콘텐츠는 biofilm에서 비 생물 적인 콘텐츠 (예: microplastics). 데이터의이 세트는 보다 시각적 확률적 이웃 (viSNE)16, 데이터의 신속 하 고 쉽게 해석 가능 하 게 포함을 사용 하 여 계산 시각화를 통해 분석. 몇 주를 설정 하 고 메서드를 최적화 하는 데 필요한 있지만 한번 설정 하 고, 결과 해석 하는 biofilm 샘플 수집에서 단 몇 시간 걸리는.
다른 사람 제시 방법의 주요 장점은 속도 분석 및이 정보 콘텐츠는. 또한, 샘플의 그들의 광 손실 및 형광 속성 없이 컬렉션 후 몇 주 동안 저장할 수 있습니다. 샘플의 많은 수의 큰 샘플링 연구 등 biomonitoring 프로그램 필요 하지만 상당한 양의 작은 예비 연구에 정보를 제공할 수 있습니다 때이 매우 유용할 수 있습니다.
제시 프로토콜 스트림의 다른 위치에서 수집 된 광합성 biofilms (periphyton)의 흐름-cytometric 분석을 기반으로 합니다. 프로토콜, 예를 들면 목적, 모니터링에 대 한 적절 한 사이트의 선택의 많은 단계 연구의 목표에 따라 달라 집니다 그리고 그러므로 처방 될 수 없습니다. 다른 더 적은 자유를 허용 하 고 필요한 프로토콜은 밀접 하 게 뒤에, 상세한 프로토콜 아래에서 분명히 만든.
프로토콜은 biofilm 기반 환경 모니터링에 대 한 사이트의 선택과 시작합니다. 다음 단계는 set-up 교류 cytometer (FC)의 측정 사용 모니터링된 환경에서 biofilms에 살고 다른 광합성 유기 체 사이 차별. 이 사이트를 식별 하는 다른 종에 존재 하는 biofilm 고 교류 cytometer 레이저와 광학에 적절 한 측정을 사용할 수 있는 필터 설정의 형광 속성에서 biofilm 샘플을 수집 하 여 수행 됩니다. 파장입니다. Biofilms 수 FC 설정 후 사이트에서 주기적으로, cytometry에 의해 측정 하는 biofilm 및 시각적 클러스터링 분석 데이터에 단일 입자의 광학 및 형광 재산 수집. 결과의 더 나은 해석에 대 한 로컬 biofilm 살아있는 종의 FC 참조 데이터베이스 및 그들의 고기를 빌드하고 FC 데이터에서 다른 분류를 식별 하는 데이터베이스를 사용 가능 하다. 유효성 검사 FACS 및 현재 종의 분류학 식별 현미경-기반을 사용 하 여 단일 셀의 확인 된 클러스터의 정렬 형광 기반을 통해 가능 하다. 프로토콜의 회로도 그림 1에서 주어진 다.

<table><tbody><tr><td>Multimeter</td><td>WTW</td><td>MultiLine 3620 IDS</td><td>For measuring temperature, pH, dissolved oxygen</td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner</td><td>VWR International</td><td>97043-986</td><td>Tank dimesions: 15*14*10 cm</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios</td><td>Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td>used for selecting appropriate setting of the FC</td></tr><tr><td>Cell sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios</td><td>Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 135</td><td>Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective</td></tr><tr><td>SOFTWARE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>R2013a</td><td>software for numerical computing</td></tr><tr><td>CYT</td><td>Dana Pe&#039;er Lab</td><td>Version 1.1</td><td>free interactive visualization tool for analysis of cytometry data</td></tr></tbody></table>

characterization of aquatic biofilms with flow cytometry

Biofilms는 민물 생태계에서 중요 한 역할을 하는 미생물의 동적 컨소시엄. 그들의 사회 구조를 바꾸어 서, biofilms 환경 변화에 신속 하 게 대응 하 고 따라서 수 질의 지표로 사용할 수 있습니다. 현재, biofilm 평가 주로 기반으로 통합 및 기능 끝점, 광합성 이나 호흡 활동, biofilm 커뮤니티 구조에 정보를 제공 하지 않습니다를 합니다. Cytometry 및 전산 시각화 커뮤니티 구성, 특히 민물 biofilms의 photoautotrophic 부분에 대 한 평가 대 한 대안, 민감한, 그리고 사용 하기 쉬운 메서드를 제공합니다. 전체 샘플 교류 cytometer 통해 실행 후 기본 샘플 준비를 필요 합니다. 단일 셀 광과 형광 정보 전산 시각화 및 생물 학적 해석에 사용 됩니다. 다른 방법에 비해 주요 장점을 분석 하 고이 정보 콘텐츠 자연의 속도. Cytometry 단일 측정에 여러 휴대 및 biofilm 특성에 정보를 제공 합니다: 입자 크기, 밀도, 안료 콘텐츠, biofilm, 및 거친 분류학 정보 abiotic 콘텐츠. 그러나, 그것은 종 수준에 biofilm 구성에 정보를 제공 하지 않습니다. 우리 수생 생태계의 환경 모니터링을 위한 방법의 사용에서 높은 잠재력을 하류 알리는 단계 초기 biofilm 평가로 보완 하 고 더 상세한 방법으로 조사를 상세한.

(그림 1)을 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 스위스에서 로컬 스트림의 여러 사이트에서 샘플 분석 했다. 각 사이트에서 3 개의 비슷한 크기의 돌 (10-12 cm) 찍은, 그리고 biofilms 돌 닦 했다. 샘플 다음 sonicated, 고정, 필터링 되었고 나중 cytometry에 의해 분석. 교류 cytometer와 사용 하는 참조 데이터베이스의 설치 이전 종이15에 설명 된 ?...

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Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Cytometry와 수생 Biofilms의 특성

시각적 클러스터링 함께에서 cytometry 수생 biofilms 공부는 쉬운--사용 하 고 빠른 방법을 제공 합니다. 그것은 biofilm 특성, biofilm 커뮤니티 구조에 변화의 탐지 및는 biofilm에 포함 하는 비 생물 적인 입자의 탐지에 사용할 수 있습니다.

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

characterization-of-aquatic-biofilms-with-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Environment

8.9K 조회수.  Eawag - Swiss Federal Institute for Aquatic Science and Technology. 시각적 클러스터링 함께에서 cytometry 수생 biofilms 공부는 쉬운--사용 하 고 빠른 방법을 제공 합니다. 그것은 biofilm 특성, biofilm 커뮤니티 구조에 변화의 탐지 및는 biofilm에 포함 하는 비 생물 적인 입자의 탐지에 사용할 수 있습니다.

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Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling protocols include the assessment of resources available to the microbial community (dissolved organic carbon, particulate organic matter, inorganic nutrients), and a comprehensive description of the viral and bacterial communities (via direct viral and microbial counts, enumeration of autofluorescent microbes, and construction of viral and microbial metagenomes). We use a combination of methods, which represent a dispersed field of scientific disciplines comprising already established protocols and some of the most recent techniques developed. Especially metagenomic sequencing techniques used for viral and bacterial community characterization, have been established only in recent years, and are thus still subjected to constant improvement. This has led to a variety of sampling and sample processing procedures currently in use. The set of methods presented here provides an up to date approach to collect and process environmental samples. Parameters addressed with these protocols yield the minimum on information essential to characterize and understand the underlying mechanisms of viral and microbial community dynamics. It gives easy to follow guidelines to conduct comprehensive surveys and discusses critical steps and potential caveats pertinent to each technique.

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

물 화학 및 해양 미생물에 필드 가이드 - 바다에서 보이지 않는 선수를 해명

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

연구

환경과학

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

면역학 및 감염병학

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical applications driven by microorganisms. Next generation sequencing methods are widely utilized to resolve microbiomes, but they are generally resource and time intensive and deliver mostly qualitative information. Flow cytometric microbiome analysis does not suffer from those disadvantages and can provide relative subcommunity abundances and absolute cell numbers at-line. Although it does not deliver direct phylogenetic information, it can enhance the analysis depth and resolution of sequencing approaches. In sharp contrast to medical applications in both research and routine settings, flow cytometry is still not widely used for microbiome analysis. Missing information on sample preparation and data analysis pipelines may create an entry barrier for the researchers facing microbiome analysis challenges that would often be textbook flow cytometry applications. Here, we present three comprehensive workflows for pure cultures, complex communities in clear medium and complex communities in challenging matrices, respectively. We describe individual sampling and fixation procedures and optimized staining protocols for the respective sample sets. We elaborate the cytometric analysis with a complex research centered and an application focused bench top device, describe the cell sorting procedure and suggest data analysis packages. We furthermore propose important experimental controls and apply the presented workflows to the respective sample sets.

Flow cytometric analysis has proven valuable for investigating pure cultures and monitoring microbial community dynamics. We present three comprehensive workflows, from sampling to data analysis, for pure cultures and complex communities in clear medium as well as in challenging matrices, respectively.

특성화 미생물 역학-Cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

수생 생태계에서 유기 탄소 흐름의 새로운 경로를 밝히기 위해 추적자로 형광으로 분류 된 박테리아

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

생체공학

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

분자 프로브 최적화 (광합성 생물의 세포 사망을 확인하는 방법<em&gt; Microcystis aeruginosa의</em&gt;) 유동 세포 계측법을 사용하여

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

의학

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 Biofilm 개발의 정량화

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Cytometry와 수생 Biofilms의 특성

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