この実験では、C2C12筋芽細胞は、タツノオトシゴの細胞培​​養プレートの所定の密度で播種する。基礎酸素消費量（OCR）と細胞外酸性化（ECAR）のレートは、ベースラインの速度を確立するために測定されます。 1。細胞のインジェクション細胞は、代謝細胞の生体エネルギープロファイルを移すの異なる化合物の三の追加（連続で）によって摂動されています。一つのグループはコントロール&quot;化合物&quot;として追加されたメディアを実行すると、コントロールとして機能します。 <ol><li>最初の注射は、オリゴマイシンです。オリゴマイシンは、F Oの部分はATP合成酵素（複合体V）のプロトンチャネルを遮断することによってATP合成を阻害する。ミトコンドリアの研究では、それは状態3（リン酸化）呼吸を防ぐために使用されます。細胞と、それはATPの合成とミトコンドリア内膜を横切る自然のプロトンリークを克服するために必要な酸素消費量の割合に専念O2消費量の割合を区別するために使用することができます。 </li><li>目の注射はFCCPです。 FCCP（カルボニルシアニド- P - trifluoromethoxyphenylhydrazone）は、モバイルイオンキャリアであるイオノフォアである。それはミトコンドリア膜の代わりに、ATP合成酵素（複合体V）のプロトンチャネルを介して水素イオンを輸送することによってATP合成を中断させるためには、脱共役剤である。ミトコンドリア膜電位のこの崩壊は、ATPの生成なしにエネルギーと酸素の急速な消費につながる。この場合、OCRおよびECARの両方がATPを生成する解糖を使用して、エネルギーバランスを維持するために細胞の試みとして、脱共役によるOCR、およびECARが増加します。 FCCPの治療は、最大限の制御されていないOCRと初期基底OCRとの間の量的な差として定義されているセルの&quot;スペア&quot;呼吸器の容量を計算するために使用することができます。それも、最大限の生理学的または病態生理学的刺激の条件の下でいくつかの予備呼吸容量のメンテナンスは、活力と/または細胞の生存を定義する主要な因子であることが提案されている。増大するエネルギー需要の条件の下でストレスに応答する細胞の能力は、ミトコンドリアの生体エネルギー容量の影響を受けた大部分になります。この生体エネルギー容量は、ミトコンドリアへの基質を提供する細胞の能力と電子輸送に関与する酵素の機能的能力など、いくつかの要因によって決定される</li><li> 3回目の注射では、ロテノン、コンプレックスI阻害剤は、細胞に添加される。これは、ミトコンドリアの呼吸をシャットダウンして計算される呼吸に寄与するミトコンドリアと非ミトコンドリア分画の両方を有効にします。細胞はそのエネルギーのバランスを維持するために、より多くの糖の状態に移ると一つはECARの併用増加に伴って、障害ミトコンドリア機能のためにOCRの減少が観察される ロテノンは、私はユビキノン（コエンザイムQ）にコンプレックス中のFe - Sセンターからの電子の移動を妨げるミトコンドリア阻害剤です。コンプレックスのこの阻害は、私はATPの形で利用可能なエネルギーに変換されるからNADHの​​ポテンシャルエネルギーを防ぎます。 </li></ol> 2。試薬および材料<ol><li>オリゴマイシン、FCCP、およびロテノンソリューション（タツノオトシゴ水戸ストレステストキット） </li><li> DMEMを実行しているメディア（タツノオトシゴ＃100965〜000） </li><li> DMSO（Sigma社製D8418） </li><li>蒸留水（ギブコ15230〜170） </li><li>キャリブレーションバッファ（タツノオトシゴバイオサイエンス） </li></ol> 3。成長中<ol><li> 500 mLのDMEM（ギブコ11965〜092） </li><li> 10％FBS（Hyclone SH90070.03） </li><li> 5mLのペン/連鎖球菌（ギブコ15140〜122） </li><li> 5mLのピルビン酸ナトリウム（シグマS8636） </li><li> 5mLのグルタミン（ギブコ35050〜061） </li></ol> 4。播種プロトコル<ol><li>細胞/ウェルの増殖培地100μLで10,000個の細胞でXF96細胞培養プレートに播種し、10％CO 2で℃のインキュベーター37に配置されます。 </li><li>細胞は1時間以内XF96細胞培養プレートに付着される。 </li><li>播種後XF96 24時間でアッセイ細胞。 </li></ol> 5。アッセイのテンプレートの準備<ol><li>アッセイウィザード（付録I）を使用して、次のグループのレイアウトとテンプレートを生成します。 <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。列とグループの割り当てを識別するもグリッドレイアウト</li></ol> 6。化合物の準備<ol><li>次のように、XF DMEMアッセイメディアの次の化合物を準備します。 10μMのオリゴマイシン、30.0μMのFCCP、20.0μMのロテノン、 これらの濃度は、化合物が井戸に注入されるときに行われる10倍の希釈を表しています。使用濃度は以下のとおりです。 1μMのオリゴマイシン、3.0μMのFCCP、2.0μMのロテノン</li></ol> 7。メディアの変化と細胞調製<oL&gt; <li> XFプレップステーション上のセルプレートを置きます</li><li>ウェルあたり160μLの培地の最終容量を設定します。 </li><li>細胞はアッセイ培地で予め平衡化するまで60分間CO 2を使わずに 37℃のインキュベーターでインキュベートする。 </li></ol> 8。センサーカートリッジのロード<ol><li> 37〜暖かい化合° Cの前のセンサーカートリッジをロードし、次のようにインジェクタのポートに化合物をロードする。 <ol><li>列1-4：それぞれポートA、B、C、に負荷16、18、およびXFアッセイ培地（DMEM）の20μL。 </li><li>列5-12： ポートにオリゴマイシンの16μLをロードする ポートBにFCCPの18μLをロードする ポートCにロテノンの20μLをロードする</li></ol></li></ol> 9。プロトコルコマンド<table border="1"><tbody><tr><td> コマンド </td><td> 時間（分） </td><td> ポートは </td></tr><tr><td>調整する</td><td></td><td></td></tr><tr><td>平衡化</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ループスタート</td><td> 3X </td><td></td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td>待つ</td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td>測定</td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td>ループエンド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注入する</td><td></td><td> A </td></tr><tr><td>ループスタート</td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td>待つ</td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td>測定</td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td>注入する</td><td></td><td> B </td></tr><tr><td>ループスタート</td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td>待つ</td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td>測定</td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td>注入する</td><td></td><td> C </td></tr><tr><td>ループスタート</td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td>待つ</td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td>測定</td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td>エンド</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1。プロトコルコマンド

<ol>
	<li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li><li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway.">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li><li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion.">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li><li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells:+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li><li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor.">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li><li>Mor&#225;n, M., Rivera, H., S&#225;nchez-Arag&#243;, M., Bl&#225;zquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Mart&#237;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts.">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li><li>C&#225;rdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molg&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2++transfer+to+mitochondria.">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li></ol>

ボージェンセン、ジョージW.ロジャース、およびDavid A. Ferrick毎分呉は、この記事で紹介試薬や計測機器を生産するバイオサイエンスタツノオトシゴ、の従業員です。

このアッセイは、ミトコンドリアの機能を調べるために古典的な実験から導出され、細胞の代謝、ミトコンドリアの機能、および全体的な生体エネルギーの様々な変化を理解することを目的とした、より複雑な実験を構築することでフレームワークとして機能します。 この実験で使用されるすべての化合物は、最大限の効果を提供する濃度のために最適化する必要があります。つまり、1つは、これらの値を確認するために別々の滴定の実験を実行する必要があります。滴定曲線は非常にシャープになる傾向がある、とあまりにも多くのFCCPは、実際にOCRでの応答を減少させることができるので、これは、FCCPは特に重要です。テストする典型的な範囲は、（最終濃度）のようになります。 <ul><li> 0.1 - オリゴマイシンの1.0 ug / mlと</li><li> 0.1から5.0μMのFCCP </li><li> 0.1から1.0のUMロテノン</li></ul>上記の各化合物（特にFCCP）への応答をアッセイ培地組成物（基本型、[グルコース]、[ピルビン酸] BSAの、存在/非存在、など）によって影響されることに注意してください。 XFのアッセイ培地組成が変更された場合、さらに、最適化を再実行する必要があります。プレゼンスとピルビン酸の濃度は、FCCPによる最大呼吸の能力を得ることに特に重要です。バイオサイエンスタツノオトシゴは、ピルビン酸の不作為は、FCCPに（ベースラインの上）に最大限に対応する細胞の能力をabrogatesているセルの行数で観察している。通常は、1〜10 mMのピルビン酸の濃度は、最大呼吸を得るためにピルビン酸の至適濃度を理解するためにテストする必要があります。なお、[ピルビン酸]と[グルコース]実験のための最適培地条件を得るために&quot;クロス滴定&quot;になる必要がある。 この実験の典型的な結果は、OCR対時間と、別表示ECAR対時間を示すグラフで、以下に提示されています： <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。OCR対時間<img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。ECAR対時間セルが連続する各化合物で処理されるためここでは、OCRとECARで期待される応答を観察した。オリゴマイシンの場合は、OCRは、細胞がOXPHOSを経由してATPを合成することができないので、彼らはATPに対する需要を満たすために解糖に戻すミトコンドリア複合体VでブロックしてATP合成の結果として減少し、従って我々はECARの増加を観察。前述のように、FCCPは、脱共役剤として作用する。細胞は現在、ミトコンドリア内膜を横切るプロトンリークを克服する必要があるため、より多くの酸素がミトコンドリア膜を渡って過剰なプロトンをポンプするために消費されると、OCRが大幅に増加します。最後に、ロテノンは、それぞれ、ミトコンドリア複合体Iと複合体IIIを阻害するには、電子伝達系で停止する電子の流れを引き起こすため、O2の消費量が大幅に削減されます。 <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="図4" /> 図4の呼吸パラメータ呼吸とECARで予想される変化を超えて、呼吸器のパラメータの数はこのデータから得ることができる。これは、上図にまとめられています。 ここで我々は細胞の基底呼吸、ATPの生産と同様にプロトン勾配を（H +リークが原因で）維持に費やさ金額に捧げられた酸素消費量のパーセントについての情報を取得する可能性があることを参照してください。さらに、我々は非連動呼吸（時々予備の呼吸器の容量と呼ばれる）の条件下で最大呼吸速度を取得することができると最終的に、我々は、ミトコンドリアのプロセスによるものでは酸素消費量を決定することができます。 研究の急増は、細胞の生体エネルギーを評価するミトコンドリアの機能障害を特定し、ストレス及び/または侮辱に応答する細胞の能力を予測するために、このミトコンドリアのプロファイルを採用しています。この実験的な方法と予備の呼吸容量の考え方についての詳細情報および詳細については、以下の資料1-8を参照して参照してください。

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Mito Stress Test Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM Running Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>100965-000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Distilled Water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15230-170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calibration buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bioenergetic profile experiment using c2c12 myoblast cells

細胞代謝を測定し、ミトコンドリアの機能障害を理解する能力は、肥満のミトコンドリアの機能の役割を理解する上で自分の研究を進めるために世界中の科学者、糖尿病、老化、癌、心血管機能と安全性の毒性を有効にしている。 細胞の代謝は、酸素、グルコース、脂肪酸、およびグルタミン、および酵素的に制御された酸化および還元反応の一連を通して、その後のエネルギー変換などの基質の取り込み、のプロセスです。このような細胞外環境への乳酸やCO 2などのATPの生産、熱や化学副産物のリリースでは、これらの細胞内の生化学反応の結果。 酸素消費速度 - - またはOCR細胞の生理的状態、およびそれらのセルの状態の変化に貴重な洞察力は、細胞、ミトコンドリア呼吸の指標で消費される酸素の割合を測定することによって得ることができる。細胞はまた、解糖、すなわちを通じてATPを生成する：酸素の乳酸、独立へのグルコースの変換。培養ウェル内で、乳酸は、プロトンの主要な源である。またはECAR - 培地の酸性化は、細胞外酸性化速度を提供する原因となる細胞を周囲の細胞外培地中に放出陽子、を介して間接的に生成された乳酸を測定する。 この実験では、C2C12筋芽細胞は、タツノオトシゴの細胞培​​養プレートの所定の密度で播種する。基礎酸素消費量（OCR）と細胞外酸性化（ECAR）のレートは、ベースラインの速度を確立するために測定されます。その後、細胞を代謝的に細胞の生体エネルギープロファイルをシフトする別の化合物（連続）の三添加によって摂動されています。 このアッセイは、ミトコンドリア評価するために古典的な実験から導出され、ミトコンドリアの生理学的および病態生理学的機能の両方を理解することを目的とした、より複雑な実験を構築するために、ストレスおよび/または侮辱に応答する細胞の能力を予測することでフレームワークとして機能します。

Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells at JoVE.com

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

細胞内のミトコンドリアの機能をプロファイリングするための方法の説明が表示されます。基礎呼吸速度、ATP -結合型呼吸、プロトンの漏れ、及び予備容量：生成されたミトコンドリアのプロファイルは、1つの実験で測定することができるミトコンドリア機能の4つのパラメータを提供します。

C2C12筋芽細胞を用いた生体エネルギープロファイル実験

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

bioenergetic-profile-experiment-using-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

50.2K ビュー.  Novato, CA. 細胞内のミトコンドリアの機能をプロファイリングするための方法の説明が表示されます。基礎呼吸速度、ATP -結合型呼吸、プロトンの漏れ、及び予備容量：生成されたミトコンドリアのプロファイルは、1つの実験で測定することができるミトコンドリア機能の4つのパラメータを提供します。

ビデオ: Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

人工飼料の実験を使用してアブラムシにニコチン耐性をテスト

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

生物学

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

モリス水迷路実験

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

ゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイル解析

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

基礎脊椎動物の系統からの一次筋原前駆細胞/筋芽細胞培養液の調製

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

における代謝プロファイルのリアルタイム分析<em&gt;エクスビボ</em&gt;マウス腸陰窩オルガノイド培養

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

高感度免疫組織化学を使用してシトシンの修飾された形態の検出

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

筋芽細胞の分化と融合中にトラック核へライブ イメージングを利用しました。

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...