Eni 社の動物施設については、繁殖と博士ヌーノ ライムンド原稿の有用なコメントのために動物の世話人に感謝いたします。イオ ミンは Emmy Noether 若手研究者賞および SFB-1190 (P02)、プロジェクト共同研究センター SFB-889 (プロジェクト A8) を通じてドイツ研究振興協会 (DFG) からの補助金によってサポートされている (1702/1)。ガイドライン作成は、神経科学、生物物理学、分子生命科学 (GGNB) のゲッティンゲン大学院フェローシップによってサポートされます。

ここで報告したすべての動物実験は動物福祉のためのヨーロッパの指針に基づいて実施される (2010/63/EU) Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (ラーベス)、登録番号 14 の承認で/1701。
1. 研究デザイン
<ol><li>動物の行動の仕事は、慎重な計画を必要とする実験を設計しながら次のパラメーターを検討します。<ol>
<li>グループごとに必要な動物の数です。<ol>
<li>(例えばパス、EDA、または GPower) 必要なグループのサイズを計算する統計ソフトウェアを使用します。 注: グループのサイズは、動物と表現型の重症度との相違に依存します。動歩行解析のためネズミの数は通常 10-20 グループごとであります。</li>
		</ol>
</li>
		<li>実験動物のセックス。<ol>
<li>動物の系統によって、実験に及ぼすエストロゲンのレベルを検討します。 注: 多くの行動研究は、実験に及ぼすエストロゲンの影響を避けるために男性に集中します。これらの影響は、動物の背景系統によってもっとまたはより少なく強い。</li>
			<li>男女が使用される場合、性の影響をテストし、必要があるときに独立して 2 つの男女を評価します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>実験動物の時代。<ol>
<li>のみ 1 回限りのポイントが必要な場合は、大人動物 (2 ヶ月以上の年齢の方) を使用します。</li>
			<li>加齢とともにモーター動作の変更を検討するときは、いくつかの時間ポイントを選択します。最も早く可能な時間ポイントは 1 ヶ月、マウスは、母親から引き離されます。例えば、 1、2、または 3 か月ごと定期的に動物をテストします。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>動物の動作テストを実施する地元当局からの承認を申請します。</li>
	<li>実験動物の調達計画を立てます。<ol>
<li>繁殖計画を立てる、またはとき、実験開始日に十分な実験動物が利用できるようにタイムリーに動物のディストリビューターにお問い合わせください。</li>
		<li>新しい部屋の/設定、実験中に保持されている場合、1 週間の習慣になって動物を許可します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ビデオ録画
注: 運動学的歩行分析の使用を示すためには、ここで市販イメージング システムとその付属のイメージング解析ソフトウェア (材料の表を参照) を使用します。
<ol><li>コンピューターと撮像素子のソフトウェアを起動します。</li>
	<li>ホームおり、観察してみるとバランスの重さによって健康状態とそれぞれの動物の幸福を決定します。</li>
	<li>必要に応じて、ブラシで動物の足に赤い指塗料を適用優しく。予備のきれいなケージで 〜 5 分間乾燥する塗料を許可します。 メモ: は、塗料は足と体のコントラストを高めるために動物の腹部を塗装しないでください。黒指塗料の修正のために便利を持っていると便利です。褐色の毛皮を持つ動物のため、この手順は必要またはケースの足が同定の入れ墨をされました。1 つの動物の足を描画するを選択した場合同じグループとコントロール グループのすべての動物は、同様に塗装する必要があります。</li>
	<li>装置の右上のパネルでトレッドミルの速度を設定します。1 つ以上の走行速度を適用する場合は、まず最も遅い速度から始めます。</li>
	<li>試験室に動物を配置 (商工会議所を閉じるとき、尾や足をクランプを避けるため)。チャンバー内に暗い布をカバーでき、各動物に 1-2 分を調整します。</li>
	<li>「オン」の位置にトレッドミル光ロータリー スイッチを回すことによって試験室でライト点灯します。トレッドミルのロータリー スイッチ、トレッドミルを開始する「転送」を撮像素子のソフトウェアで「レコード」ボタンをクリックします。 注: トレッドミルを実行中それが動物パフォーマンスを慎重に常に観察することが重要: 動物をトレッドミルの速度に追いつかない場合は、トレッドミルを直ちに停止または歩行に関連して非二次症状を示しています (などてんかん発作)。試験条件は、再調整する必要があります。</li>
	<li>安定走行に動物 (ないクイック エスケープの側面、前面、または背面に) 記録少なくとも 5 のトレッドミルを停止する前に s。撮像素子ソフトウェアを「停止」をクリックして録音を停止、トレッドミルのロータリー スイッチを「オフ」ポジションに向けます。 注: 動物の不安定な実行を避けるために立ちますいくつか秒間に実行できるようにするか (「フォワード」ではなく「逆」トレッドミルのロータリー スイッチを回す)、他の方向で実行するそれらを許可します。</li>
	<li>(分析に使用)、ビデオのセクションの開始と終点を設定することができますメニューを開きますイメージャ ソフトウェアで「処理」ボタンをクリックしてします。これを行うには、ビデオを移動する画面の下部にスライダーを使用します。</li>
	<li>始点または終点として現在の時間ポイントを選択するをクリックして"からフレーム #"および"to"それぞれ。一定の速度で安定して動作する動物の少なくとも 7 手順/足 (合計で 14 のステップ) が記載されていることを確認します。</li>
	<li>動物の個体識別、出生年月日、重量、およびセックスを入力します。コンピューターまたはサーバー上の目的の場所にデータを保存します。「カメラ」レコーディング インターフェイスに戻りますをクリックします。</li>
	<li>複数の実行速度は、記録する必要があります、手順 2.6 2.10 を目的の実行速度に。次のビデオを記録する前に赤いペンキがまだ前足で、それ以外の場合手順 2.3 に存在するを確認します。</li>
	<li>録音後、その家のケージに動物をリリースします。動物を削除すると、次の実験動物の準備に消毒剤と石鹸水とトレッドミル ベルトを徹底的にきれい。</li>
</ol>3. ビデオ処理
<ol><li>解析ソフトウェアを起動し、「勉強フォルダーを選択」をクリックして記録されたビデオのフォルダーを選択します。</li>
	<li>1 つのビデオ、またはいくつかのビデオ、連続して処理することができますをクリックして"go"を選択します。</li>
	<li>「再描画」関数を使用してマウスを実行している領域を選択このセクションは、マウスと白背景のみ含める必要があります。</li>
	<li>「逆」トレッドミル関数が以前に使用した場合は、選択"被験者の鼻は右側になるかどうかはチェックしてください >>>"ビデオの左右反転だけ左に実行している動物を分析するソフトウェアが設計されているので。「受け入れる」続行するをクリックします。</li>
	<li>「リフレッシュ」関数を使用して、既定のマスクを参照してくださいし、あしあとソフトウェアを検出します。 メモ: 左側の元のビデオが表示され、提案の足の印刷物の黒と白の画像は右側。</li>
	<li>分析のための動物の鼻の周りの赤い部分を除外マスクを変更する「長さ」と「幅」ボックスに値を入力します。色は、足と同様、その領域をマスキングしないと足と鼻の領域を誤って分類するソフトウェア可能性があります。</li>
	<li>調整スライダー「フィルター ノイズ」と「毛皮と暗いパッチをフィルター」黒と白の足の印刷を最適化します。~ 800-950 黒い動物のために、動物の正確な毛の色によって、茶色または白い動物のため 700 ~ 800 には、「ノイズ フィルター」のスライダーを設定します。設定が満足のいく「ok」を選択します。 注:「毛皮と暗いパッチをフィルター」スライダー依存方法「赤」の前足です。塗られた足の値は通常、約 100-120、非塗装の足の最高値は周り 50-100。これらの設定は、毛皮と、足の色の調整に依存する、すべての動物のために最適化する必要があります。印刷の黒と白の足として可能な限りほとんどのバック グラウンド ノイズと足の明確な表現が必要です。</li>
	<li>最初の調整を渡された 1 つまたは複数の動画を選択 (ラベルの付いた"@ @"ビデオの名の前に) これらのビデオの解析を開始する「行く」関数を選択。 注: 分析は、動画ごと 2-5 分します。この手順が実験者からの入力を必要としないので、一晩いくつかのビデオの解析を実行することが可能です。</li>
	<li>分析ビデオを選択 (ラベルの付いた"@")"go"をクリックしてそれぞれの独立した足 (歩行力学) を時間をかけてベルトとの接触 (cm2) 足エリアが画いてある今に注意してください。元のビデオと計算された足の選択範囲を印刷を比較、「動画再生」機能を使用します。</li>
	<li>次の (3) のツールを使用して、ソフトウェアによって小さな誤りを修正します。<ol>
<li>例えばソフトウェアが対応する足がベルトと接触してないのに、信号を記録するとき、間違った信号を削除するのには「正しい」のオプションを使用します。関連する領域を拡大表示するをクリックし、2 番目のクリックで削除するオブジェクトの左の枠と 3 番目をクリックすると右側の境界線をマークします。</li>
		<li>などにもかかわらず、足はベルトとの接触に、いくつかのフレームの信号を記録してないとき、2 つの信号を結合するのにには、「接続」オプションを使用します。一度をクリックして関連する領域を拡大表示し途中で結合する 2 つのオブジェクトをダブルクリックします。</li>
		<li>時間ポイントを分析から完全に削除するのに「削除」オプションを使用します。「正しい」または「接続」機能、例えば、左後肢足に左前肢足から信号が誤って記録されるときに間違いを修正できない場合にのみこのオプションを使用します。関連する領域を拡大表示するをクリックし、2 番目のクリックで削除する領域の左枠と 3 番目をクリックすると右側の境界線をマークします。 のみメモ: 小さな誤りを修正するツールを使用することがあります。(例えば、 1 つの足からの信号は非常に弱い場合) の組織的失敗を訂正できない: ビデオを解析から除外する必要があり、それぞれの動物の記録、可能なときに繰り返し。「動画再生」オプションは、「正しい」後は、もはや利用可能なノートでは、「接続」または「削除」オプションが使用されていますと編集ツールすべての 3 にリセットされます「元に戻す」ボタンをクリックしますします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>「次に上肢」を選択 4 手足進むには最後の足の後「次の肢」をクリックするソフトウェア分析を完了し、、4 つスクリーンにこの動物の結果を示します。</li>
</ol>4. 歩行分析
<ol><li>1 つの実験からすべての動画を分析するときすべての動画を選択し、「結果を再編成」をクリックして結果 (スプレッドシート ファイル内のパラメーターの一覧) をエクスポートします。</li>
	<li>終了の"reorganized_stride_info"ファイルを開くし、このスプレッドシートに含まれていない情報を追加: グループ情報 (例えば遺伝子、治療)、年齢、および別に保存された動物の長さと幅の測定スプレッドシート ファイル終了"SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info"</li>
	<li>必要に応じて、動物の幅または長さを歩行パラメーターの正規化などSL 動物の長さと SW に動物の幅に。</li>
	<li>グループ、年齢、および走行速度で結果を並べ替える: すべてのこれらの条件を個別に分析します。 注: 年齢や実行速度は、同じグループ内で併用はできません。</li>
	<li>平均値、標準偏差、およびすべての実験条件の各パラメーターの平均値の標準誤差を計算します。</li>
	<li>実験デザインによると統計分析を行う、2 尾tを使用するなど-変異/扱った動物野生型 (WT) を比較するテスト/制御、または ANOVA のいくつかの独立したグループを比較します。</li>
	<li>一見まったく測定パラメーター: 良い結果を視覚化する各パラメーターをプロットすると便利です。任意のパラメーターの統計的な差異が存在する場合は、かどうか他の依存のパラメーターを適宜変更することを確認してください。 注: たとえば、SL は特定のテスト グループに大幅に減少した場合もこう高いストライド (走行速度が同じである) ので、その結果増加 SW (姿勢の安定性を維持する) ために。</li>
	<li>モデル、最も関連のあるおよび/またはヒトの疾患の観察に匹敵するパラメーターを選択します。プレゼンテーション、グループごとに代表的な動画を作成し、以来、微妙な歩容変更がビデオから明白ではない多くの場合、関連するパラメーターの読み出しを示すグラフでそれらを補完します。</li>
</ol>5. トラブルシューティング
注: いくつかの動物は、不安の表現型、特にマウス モデルもトレッドミル上で実行のような単純なタスクを実行する難しさがあります。下位の不安レベルを取ることができるし、実行を奨励する手順を次に示します。
<ol><li>慣れや肯定的な施行。<ol>
<li>最初のテストの前に 2 〜 3 日で試験室にマウスを置き、暗い布でカバー、ライトをオフのままにします。マウス 〜 5 分追加チョウの新しい環境や試験室にチョコレート/ナット バターを (例えばヌテッラ) 肯定的な連合を形成する可能性がありますので調整をしましょう。</li>
	</ol>
</li>
	<li>空気のパフ/リアの境界によって否定的な施行。<ol>
<li>マウスは空気のパフや、その背後にある運動好きではないと妨害から実行されます。実行をやる気にさせるには、穏やかな空気のパフや試験室は、試験室の前部の方にマウスを奨励するためのリアの境界を形成する柔軟なバーのリズミカルな動きを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>起動が遅い。<ol>
<li>高速の実行速度をテストするとき低速でトレッドミルを起動し、目的のテスト条件に向かってトレッドミルの速度をゆっくり増加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>自由な動きを最小限に抑えます。<ol>
<li>テスト部屋の長さは、前面と背面の 2 つの調節可能なバーによって制限されます。試験動物が走行速度を維持、着実に実行されない場合より安定した実行の結果を商工会議所の長さを制限します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>上記測定が成功しなかった場合は、次の日に実行を記録します。動物はまだ後 3 日間のテストを実行することを拒否、発見として記録し、さらにテストから動物を除外します。 注: 歩行分析の結果は、良い品質のビデオ録画に依存します。動画は慎重に記録されている場合、解析中に動画を除外する理由はないです。ビデオの品質が不足している場合明らかになる段階 3.6 デジタル足のプリントを作成するためのパラメーターが設定されているとき。足と鼻以外の部位が赤表示されます (例えば性器や腹部に指塗料マイメロディ周り不足している毛皮のため)、品質が大幅に低下します。3.6 のステップで調整できるだけ小さな問題を修正する、これは許容可能な信号/ノイズ比にビデオをもたらすことはできません、する場合、解析から除外する必要がありますビデオと記録が繰り返される必要があります。したがって、録音が実行された後すぐに動画を分析することをお勧めします。</li>
</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

神経変性疾患、特に PD 運動協調性は深刻な影響を受けるのような病気のためのモデルの特性評価に有用なアプローチは、運動の協調性を学ぶします。運動歩行分析の機能分析の助けを借りて、我々 は弱い神経変性とそれ故に比較的控えめな表現型歩行問題の発症で動物の歩行またはモデルの微妙な変化を識別できます。小さな歩行異常、重度の運動障害を含む神経変性疾患の様々 なモデル?...

神経変性疾患の患者・家族・社会に深刻な負担を課すこと、平均寿命が上がるにつれて、関心が大きくなるし、世界の人口でエージングを続けます。神経変性疾患の最も一般的な症状の一つはバランスと機動性の問題です。したがって、特性 (例えば、齧歯動物) の哺乳類の老化運動行動のモデル、またはモデルの神経変性の表現型を示すが生体内で関連性を示す特定の動物モデルまたは治療する貴重なツール病気の症状を改善することを目指して治療します。神経変性疾患の治療にほぼすべてのアプローチは最終的に人間の臨床試験の開始前に動物モデルでのテストが必要です。したがって、一貫して年齢の進行に沿って病に関連した表現型を定量化するための in vitroモデルの可能性を示した、候補薬ができるようにするために使用できる信頼性の高い、再現可能な動作テストすることが重要です。生きている動物の表現型を効果的に改善します。
齧歯動物の運動行動評価の 1 つの側面は、VPI (また呼ばれる腹面ビデオ撮影)1,2で行うことができる運動歩行分析です。透明およびモーターを備えられたトレッドミル ベルト1,2,3,4の頂上に歩いて齧歯動物の下側の連続記録この確立されたメソッドを使用します。ビデオ フィード データの解析が動的にかつ確実に要約齧歯動物の歩行パターンでは、もともとケールらで定義されているすべての 4 つの手足の「デジタル足プリント」を作成します2 Amendeら3。
イメージングに基づく歩行分析の原則は、それぞれの個々 の足の時間をかけてトレッドミル ベルトと接触して手領域を測定することです。すべての姿勢は、足エリア (ブレーキの段階では) で、(推進中) 足の面積の減少の増加によって表されます。これは、信号が検出されない遊脚相が続きます。スイングやスタンス一緒にストライドを形成します。歩行ダイナミクスのパラメーターに加え、姿勢パラメーターは、記録したビデオから抽出できます。模範的なパラメーターと定義の表 1に掲げるとスタンス幅 (SW; 前部または後部足から吻尾軸までの複合距離) を含む、歩幅 (SL; 同じ足の 2 つの前進間の平均距離)、または足の配置角度 (吻尾軸に足の角度)。姿勢と歩行の動態データを許可 (姿勢パラメーターと複数のステップ変動) による動物のバランスと (歩行力学パラメーター) によって調整に関する結論を引き出す。運動失調係数 (SL 変動 [(最大で計算など、その他のパラメーターSL−min。SL) 意味する SL/])、後肢共有スタンス時間 (両後肢がベルトに接触している時間) または足ドラッグ (リフトオフの手による姿勢からベルトに足の総面積) も抽出することができます、様々 な神経変性 · ディ · 変更する報告されています。病モデル5,6,7,8 (表 1参照)。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>パラメーター</td>
			<td>ユニット</td>
			<td>定義</td>
		</tr>
<tr>
<td>スイング ・ タイム</td>
			<td>ms</td>
			<td>足はベルトとの接触時間の期間</td>
		</tr>
<tr>
<td>立ち時間</td>
			<td>ms</td>
			<td>足はベルトとの接触時間</td>
		</tr>
<tr>
<td>% ブレーキ</td>
			<td>立ち時間の %</td>
			<td>姿勢の時間足、ブレーキの段階の割合</td>
		</tr>
<tr>
<td>% を推進します。</td>
			<td>立ち時間の %</td>
			<td>足は、推進段階スタンス時間の割合</td>
		</tr>
<tr>
<td>スタンス幅</td>
			<td>cm</td>
			<td>前部または後部足から吻尾軸までの距離合計</td>
		</tr>
<tr>
<td>ストライドの長さ</td>
			<td>cm</td>
			<td>同じ足の 2 つの前進間の平均距離</td>
		</tr>
<tr>
<td>ストライド</td>
			<td>前進/s</td>
			<td>1 秒あたりの完全な大またの数</td>
		</tr>
<tr>
<td>足の配置角度</td>
			<td>度</td>
			<td>動物の吻尾軸に関連して足の角度</td>
		</tr>
<tr>
<td>運動失調の係数</td>
			<td>a.u.</td>
			<td>SL [(max SL-min SL)/平均によって計算された SL 変動]</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 共有姿勢</td>
			<td>スタンスの %</td>
			<td>後肢共有姿勢の時間;両後肢が同時にベルトと接触している時間</td>
		</tr>
<tr>
<td>足ドラッグ</td>
			<td>mm2
</td>
			<td>リフトオフの手による姿勢からベルトに足の総面積</td>
		</tr>
<tr>
<td>肢荷重</td>
			<td>cm2
</td>
			<td>最大ダ/dT;速報段階では足の変化の最大レート</td>
		</tr>
<tr>
<td>ステップ角度変動</td>
			<td>度</td>
			<td>後肢の間の角度の標準偏差は、SL と SW の関数として足します。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。腹面イメージングによってテストすることができますキー歩行パラメーターの定義。
神経変性疾患モデルマウスの運動行動の評価は与えられた年齢での特定のモデルの表現型の重症度に応じて挑戦することができます。いくつか病気、最も目立つように PD を強力なモーター動作 (歩行) 赤字は、患者と動物モデルの両方。PD の 4 つの主症状の一つは加齢とともに進行し、PD9の初期の段階で既に重度の歩行障害のマニフェスト運動緩慢です。急性の PD モデル 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) が奏効の齧歯動物の研究は既に VPI 歩行分析10、11,12を使用しています。しかし、このモデルの急性の性質を考えると、これらの研究は対処できません加齢に伴う運動障害の進行。いくつかの最近の研究はたとえば13,14,15, 加齢とともに病気の進行を理解することの関連性を強調して神経変性変化高齢マウスにおける歩行分析を行った.
運動障害に加えて神経変性疾患の動物モデルはしばしば検討タスクに焦点を当て問題を抱えるし、加齢と共に特に顕著な認知障害を示します。このような表現型はモーターの動作テストの結果に影響を与えます。すなわち、rotarod テスト16、運動障害を調べる最も広く使用されている試験の一つは、認知、注意、およびストレス17,18に依存します。モーターを備えられたトレッドミルの上を歩く意欲は、またこれらの要因によって異なります記録の読み出しを実行すると、標準的な機能であるし、これまで変更された認知の影響は小さい。ストレスと注意の影響は、全体的な実行能力ではなくスイング ・ スタンス時間の応力、および注意19、20SL のような特定のパラメーターで表示ことがあります。
運動学的歩行分析のアプローチをさらに齧歯動物モデルの課題を調整するオプションを持つことの利点を提供しています。調整可能な角度とスピードでトレッドミルにより、歩行速度 0.1 ~ 99.9 cm/s、重度の歩行障害を持つ齧歯類は遅い速度で実行することができますように (~ 10 cm/s)。高速走行速度で測定できる非障害動物 (30 - 40 cm/s)。テストの動物が一定の速度で実行することができるかどうかの観察は、それ自体で結果を提供します。さらに、齧歯類は、ゴニオメータの助けを借りて、希望の角度にトレッドミルを傾けることによってまたは加重そりをマウスまたはラットの後肢にアタッチすることにより減少、上下、傾斜を実行するさらに挑戦しました。
患者で変異が単一のタンパク質の多くの研究に加えて不良エンドサイトーシス プロセスと神経変性13,21,22、間のリンクの最近の増加の意識があります。 23,24,25,26,,2728。エンドフィリン A の減らされたレベルを持つモデルをマウス (今後エンドフィリン) 両方クラスリン依存性エンドサイトーシス13,21,の29,30,31の主要プレイヤー,32,33,45とクラスリン依存エンドサイトーシス34、神経変性を示し、自発運動13,21の年齢に依存して障害が判明しました。3 つの遺伝子をエンコード エンドフィリン蛋白質の家族: エンドフィリン エンドフィリン 2、1 とエンドフィリン 3。特に、エンドフィリン蛋白質の枯渇から生じる表現型は数によって大幅に異なりますエンドフィリン遺伝子13,21を不足しています。トリプル ノック アウト (KO) エンドフィリン遺伝子は致死が誕生と両方のエンドフィリン 1 と 2 失敗繁栄し、出産後 3 週間以内に死亡することがなくマウス後わずか数時間、3 つの endophilins のいずれかの単一の KO を示しています明白な表現型のテスト条件21。他エンドフィリン変異遺伝子は減らされた寿命を表示し、年齢13の増加と運動障害を開発します。例、エンドフィリン 1KO 2HT 3KO マウス表示歩行変化と運動協調性問題 (運動学的歩行分析と rotarod によってテスト) としての同腹子ながら、生後 3 か月ですでにエンドフィリン 1KO 2WT 3KO 動物表示重要です年齢13の 15 ヶ月間は運動協調性が減少します。これらのモデルにおける表現型の広大な多様性のため、識別し、さまざまな動物のモーター認知能力と時代に対応する課題を統合することができますテストを適用する必要です。ここでは、発症および神経変性変化 (すなわち、エンドフィリン変異体) を示すマウス モデルにおける運動障害の進行を評価する運動学的歩行分析に活用実験の手順を詳しく説明します。様々 な年齢や歩行障害の重要度が異なるで歩行パラメーターの測定が含まれます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DigiGait</td>
			<td style="width:123px;">Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:224px;">DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">non-transparent blanket or dark cloth</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:224px;">cover the test chamber to reduce the animal&#39;s feeling of exposure/stress</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">balance</td>
			<td style="width:123px;">e.g. Satorius</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:224px;">balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">red finger paint</td>
			<td style="width:123px;">e.g. Kreul or Staedtler</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>for increasing the contrast between paws and animal&#8217;s body</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">small paint brush</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:224px;">soft brush to apply finger paint to the animal paws</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">diluted detergent</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:224px;">for cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol</td>
			<td style="width:123px;">e.g. B.Braun</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:224px;">for desinfection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gait analysis of age-dependent motor impairments in mice with neurodegeneration

モーターの動作テストは齧歯動物モデルの機能的関連性を決定するために使用されますが、新しくをテストするこれらの動物の治療法を開発しました。具体的には、歩行解析により再収集病、筋萎縮性側アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD) など運動能力に影響を与える神経変性疾患を中心に、人間の患者で観察される関連する表現型外側硬化症 (ALS)、および他。この線に沿った初期の研究で歩行パラメーターの測定は骨の折れるとコントロールしにくい要因に依存して (例えば、走行速度、連続運転)。腹面イメージング (VPI) システムの開発では、齧歯動物でこのメソッドの運動行動の評価のための便利なツールを作って、大規模な歩行分析を実行することは不可能。ここでは、提案する神経変性; のマウス ・ モデルにおける運動障害の年齢依存進行を調べる運動学的歩行分析を使用する方法の詳細なプロトコルエンドフィリン、変性損傷が徐々 に年齢とともに増加の低下レベルでのマウスの行は例として使用されます。

運動学的歩行分析の使用を説明するために行った歩行分析いくつかエンドフィリン突然変異系統と同様に、時代の進展と WT c57bl/6 j マウスに市販の計測器とソフトウェアを使用して (テーブルを参照してくださいの材料)。このセットアップでは、透明なトレッドミルの下の高速カメラはマウス (図 1 a) の実行を記録します。ソフトウ?...

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Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration

本研究で我々 は腹面が加齢マウス モデル (例えば、エンドフィリン突然変異体の神経変性の進行と同様、モーターの調整の微妙な変化を監視するイメージングに基づく運動歩行解析の使用方法を示すマウスの行)。

神経変性疾患を持つマウスの年齢依存性運動障害の歩行分析

Motor behavior tests are commonly used to determine the functional relevance of a rodent model and to test newly developed treatments in these animals. ...

gait-analysis-age-dependent-motor-impairments-mice-with

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.8K ビュー.  European Neuroscience Institute (ENI). 本研究で我々 は腹面が加齢マウス モデル (例えば、エンドフィリン突然変異体の神経変性の進行と同様、モーターの調整の微妙な変化を監視するイメージングに基づく運動歩行解析の使用方法を示すマウスの行)。

ビデオ: Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

発生生物学

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

で活躍ERKの時空間解析<em&gt; C。エレガンス</em&gt;生殖細胞系列

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とCisによるその阻害-配位子

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

三次元レンダリングとカルビンディン抗体、解析人間の胎盤絨毛血管のネットワークを明らかにしました。

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

チミジン アナログ エドゥと線虫の生殖における細胞周期解析

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical insult to secondary injury processes, including apoptosis and inflammation. Animal modeling has been valuable in the search to unravel injury mechanisms and evaluate potential neuroprotective therapies. This protocol describes the controlled cortical impact (CCI) model of focal, open-head TBI. Specifically, parameters for producing a mild unilateral cortical injury are described. Behavioral consequences of CCI are analyzed using the adhesive tape removal test of bilateral sensorimotor integration. Regarding experimental therapy for TBI pathology, this protocol also illustrates a process for transplanting cultured cells into the brain. Neural cell cultures derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were chosen for their potential to show superior functional restoration in human TBI patients. Chronic survival of hiPSCs in the host mouse brain tissue is detected using a modified DAB immunohistochemical process.

This protocol demonstrates methodologies for a mouse model of open-skull traumatic brain injury and transplantation of cultured human induced pluripotent stem cell-derived cells into the injury site. Behavioral and histologic tests of outcomes from these procedures are also described in brief.

ヒト誘導多能性幹細胞由来神経細胞の治療移植によるマウス脳損傷の制御された皮質衝撃モデル

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

免疫不全マウスにおけるヒト骨格筋異種移植片の実行

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...