著者は NIH/日の出からのサポートを認める (HJN、R01GM084135) 水谷糖質科学 (HJN にグラント #110071) トム V. Lee を議論と、アッセイの提案に感謝している財団と Spyros Artavanis-Tsakonas、ヒューゴ ・ Bellenロバート ・ フレミング、ケン アーバイン校とプラスミドのセルラインショウジョウバエゲノム リソース センター (DGRC)。

1.シャムスノックダウンのため二重鎖 RNA (dsRNA) の準備
<ol>
	<li>Pcr の製品の
	<ol>
		<li>DsRNA の合成に使用される DNA のフラグメントを増幅するのにテンプレート、次のプライマーのペアとして野生型黄色白(y w) ゲノム DNA とpAc5.1 EGFPを使用します。次の PCR の熱プロファイルを使用: 変性 (95 ° C、30 s)、焼鈍 (58 ° C、30 s) と拡張子 (72 ° C、1 分)。 
		緑色蛍光タンパク質を強化(EGFP) dsRNA のプライマー (5' 3')- 前方プライマー GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG 逆プライマー GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG 
		シャムスdsRNA のプライマー (5' 3')- 前方プライマー TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT 逆プライマー TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA 注: EGFP dsRNA はネガティブ コントロールとして使用されます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ゲル - 製造元のプロトコルに従って商業ゲル精製キットを使用してポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の製品を浄化します。</li>
	<li>製造元のプロトコルに従って T7 プロモーターから転写できる商品を使用しての in vitro転写を実行します。</li>
	<li>製造元のプロトコルに従って RNA 精製キットを使用して dsRNA を浄化し、-80 ° C で保存</li>
	<li>次の手順 (1.5.1-1.5.5) を使用して、シャムスノックダウンの効率を評価します。
	<ol>
		<li>6 の各ウェルにも検定とプレート 5 x 105 S2 セルを使用して手動でセル 1 mL/シュナイダーの中のプレートを添加した 10% 胎仔ウシ血清 (FBS)、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシンの数。</li>
		<li>各ウェルにEGFP- またはシャムスdsRNA の 7.5 μ g を追加し、25 ° C 24 時間インキュベートします。</li>
		<li>収穫制御 (EGFP dsRNA 処理) と 25 ° C で 5 分間 1,000 x g とによると RNA 抽出キットを使用しての RNA の隔離のためのプロセスでの遠心分離によってダウン ペレット化が続く穏やかなピペッティングによるシャムスdsRNA 扱われる S2 細胞製造元のプロトコル。</li>
		<li>分光光度計およびプロセス 100 使用して RNA を定量化する商業 qPCR 試薬とプライマー ・ プローブと次の PCR の温度プロファイルを使用してステップ 1 qRT PCR のために RNA の ng: 変性 (95 ° C、15 s) と焼鈍/拡張 (60 ° C、1 分)。 注: は、プライマー ・ プローブ セットでこれらの研究でshams さんとコントロールの qRT PCR 実験用計測器については材料の表を参照してください。</li>
		<li>2-16ΔΔCTメソッドを使用して相対シャムスの mRNA のレベルを計算します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Notch 受容体とトランス間のバインドの評価-配位子
<ol>
	<li>信号受信セル (Notch 受容体を発現する S2 細胞) を準備します。
	<ol>
		<li>診断を使用して手動でのセルをカウントし、FBS と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 10% を添加したプレート 5 x 105 S2 とシュナイダーの中よく/1 mL で 6 ウェル プレートの各ウェルに安定した S2 ノッチ細胞。 注: S2 ノッチ細胞、ショウジョウバエゲノム リソース センター (DGRC) から利用可能なメディアで 200 nM メトトレキサートを追加します。0.5 mM メトトレキサート ストック溶液を調製するには、最初 1 M NaOH の 250 μ L の 20 mM メトトレキサート ソリューションを準備します。次に、このソリューションを 0.5 mM 1 M リン酸バッファー生理食塩水、-20 ° C でストアを希釈します。S2 ノッチ細胞にノッチ蛋白質の表現はpMTベクトルでショウジョウバエのメタロチオネインのプロモーターの制御下です。</li>
		<li>各ウェルに dsRNA の 7.5 μ g を追加し、25 ° C 24 時間インキュベートします。</li>
		<li>0.7 mM CuSO4ノッチの発現を誘導し、, 25 ° C で 3 日間を追加します。 メモ: CuSO4は、メタロチオネインのプロモーターによって制御タンパク質の発現を誘導するために使用されます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>信号を送る細胞 (S2 セル デルタまたは Serrate 配位子を表現する) を準備します。
	<ol>
		<li>106安定した S2 デルタまたは S2 鋸歯トムセル 1 mL で 6 ウェル プレートの各ウェルに x の検定とプレート 〜 5 を使用して手動でのセルをカウント/シュナイダーの中の井戸 10% 添加した FBS と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン。 注: は、メディアで S2 デルタ細胞の 200 nM メトトレキサートと S2 鋸歯トム細胞の 100 μ g/mL hygromycin を追加します。デルタと鋸歯状トムの式-鋸歯状12トマト タグ付きで機能的なバージョン- pMTベクトルでショウジョウバエメタロチオネインのプロモーター下にあります。</li>
		<li>0.7 mM CuSO4リガンドの発現を誘導し、, 3 h の 25 ° C でを追加します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>信号の送信と受信の細胞間の集約を実行します。
	<ol>
		<li>DsRNA 扱われる S2 を収穫 (コントロール) と穏やかなピペッティングしてプレート 2.5 x 10 の5細胞/ウェルで検定による手動カウント後 24 ウェル プレート S2 ノッチ細胞。</li>
		<li>シュナイダーの媒体の 200 μ L の総ボリュームで 5 × 105安定した S2 デルタまたは S2 鋸歯トムのセルを追加 (FBS、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 10% を添加した)。 注: 処理 (めっき、誘導、dsRNA の処理) を含むすべての S2 セルは、バイオ セーフティ キャビネットの下で行われていた。</li>
		<li>150 rpm (942.48 rad/分) で軌道シェーカーにプレートを配置します。</li>
		<li>1 分後、各ウェルの内容を混合し、集計の数を数えるために 20 μ L を取る。<ol>
			<li>同時に 10 倍の倍率 (PLL 10/0.25 目標) を使用して逆の化合物の顕微鏡下での代表的な画像を取る。</li>
			<li>手動で集計をカウント (&#62; 6 細胞) 診断。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>シェーカーにプレートを配置します。</li>
		<li>画像の取得と 5 分後と 15 分間集計のカウントを繰り返します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>トランスの定量化を実行-バインド。
	<ol>
		<li>バック グラウンド コントロールとして S2 細胞と S2 デルタまたは S2 鋸歯トムと mL あたりの集計の数を計算します。</li>
		<li>S2 ノッチと S2 デルタまたは S2 鋸歯トムセル間の mL あたりの集計の数を計算 (トランスの大きさ-バインディング)。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3。ノッチとトランス間の結合阻害の評価- Cisによって配位子の配位子
<ol>
	<li>信号受信セルを準備します。
	<ol>
		<li>シュナイダーの中よく/1 mL で 6 ウェル プレートの各ウェルのプレート 5 x 105 S2 セルは、FBS と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 10% を添加しました。</li>
		<li>各ウェルに dsRNA の 7.5 μ g を追加し、25 ° C 24 時間インキュベートします。</li>
		<li>共同 transfect dsRNA 処理細胞pBluescriptとpMT ノッチ11 (DGRC) だけで、 pMT ノッチとpMT デルタ11 (DGRC) またはpMT 鋸歯状の合計172 μ g/ウェルを使用して製造元のプロトコルに従って商業トランスフェクション試薬の濃度は DNA。 メモ: pBluescriptは、コントロールとして使用されます。共同 transfected セルは S2 ノッチと呼ばれる、&#38; デルタ過渡または S2 ノッチ &#38; 以下一時的な細胞を鋸歯状します。</li>
		<li>25 ° C 24 時間で一過性トランスフェクション S2 細胞を孵化させなさい。</li>
		<li>0.7 mM CuSO4ノッチとリガンドの発現を誘導し、, 25 ° C で 3 日間を追加します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2.2 で説明されているように信号を送る細胞を準備します。</li>
	<li>セクション 2.3 で説明した信号を送信して信号受信セル間の集約を実行します。</li>
	<li>トランスの阻害を定量化- cisによってバインド-配位子。
	<ol>
		<li>バック グラウンド コントロールとして S2 細胞と S2 デルタまたは S2 鋸歯と mL あたりの集計の数を計算します。</li>
		<li>Cisによって抑制の大きさを定量化-次のように配位子。<ol>
			<li>S2 ノッチ過渡と S2 デルタ セルの集計の数としてAを定義します。</li>
			<li>S2 セル間集計数なノッチとデルタで一過性 co transfected Bを定義 (S2 ノッチ &#38; デルタ過渡) と S2 デルタ細胞。</li>
			<li>相対的な集合Cを計算 (B x 100) =/A</li>
			<li>Cis- 100 としてリガンド (デルタまたは Serrate) – によって抑制の大きさを計算するC。 注: 例として、相対的な集計が 45%、 cisの場合-配位子はトランスを阻害すると考えられている-55% によるバインドします。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+regulates+veinlet+expression+and+establishes+boundaries+between+veins+and+interveins+in+the+Drosophila+wing.">Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).</li><li>Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling:+the+core+pathway+and+its+posttranslational+regulation.">Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation.</a> Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).</li><li>del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+significance+of+cis-inhibition+in+Notch+signalling.">Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling.</a> Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).</li><li>Sprinzak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-interactions+between+Notch+and+Delta+generate+mutually+exclusive+signalling+states.">Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states.</a> Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).</li><li>Kopan, R., Ilagan, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Notch+signaling+pathway:+unfolding+the+activation+mechanism.">The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism.</a> Cell. 137 (2), 216-233 (2009).</li><li>Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+regulation+is+central+to+Delta-Notch+signalling+required+for+Drosophila+wing+vein+morphogenesis.">Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis.</a> Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).</li><li>Lee, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+notch+signaling+by+xylose.">Negative regulation of notch signaling by xylose.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).</li><li>Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylosylation+of+the+Notch+receptor+preserves+the+balance+between+its+activation+by+trans-Delta+and+inhibition+by+cis-ligands+in+Drosophila.">Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).</li><li>Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-interactions+between+Delta+and+Notch+modulate+neurogenic+signalling+in+Drosophila.">Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila.</a> Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).</li><li>Fehon, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta,+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila.">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li><li>Fleming, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extracellular+region+of+Serrate+is+essential+for+ligand-induced+cis-inhibition+of+Notch+signaling.">An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling.</a> Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).</li><li>Saj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+ex+vivo+and+in+vivo+RNAi+screen+for+notch+regulators+in+Drosophila+reveals+an+extensive+notch+interaction+network.">A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network.</a> Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).</li><li>Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+ligand-mediated+inhibition+in+Notch+signaling+activity+in+Drosophila.">Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila.</a> Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).</li><li>Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesion+force+of+Notch+with+Delta+and+the+rate+of+Notch+signaling.">The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling.</a> J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+notch-ligand+binding+by+protein+O-fucosyltransferase+1+and+fringe.">Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe.</a> J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).</li><li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rumi+is+a+CAP10+domain+glycosyltransferase+that+modifies+Notch+and+is+required+for+Notch+signaling.">Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling.</a> Cell. 132 (2), 247-258 (2008).</li><li>Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferase+activity+of+Fringe+modulates+Notch-Delta+interactions.">Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions.</a> Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).</li><li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+EGF+repeat-8+of+Notch+discriminates+between+Serrate/Jagged+and+Delta+family+ligands.">A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands.</a> Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).</li></ol>

著者は利害の対立があります。

正規 Notch シグナルは、Notch 受容体とそのリガンド5間の相互作用に依存します。ノッチのパスに関するほとんどの研究は、主にノッチと隣接セル (トランス) の配位子の結合を検討、ノッチと同じ細胞リガンドが影響しあうか、およびこれらのいわゆるcis-ノッチの抑制的役割を果たす相互作用3,4をシグナリングします?...

正規 Notch シグナルは、隣接するノッチの受容体とそのリガンド1間の相互作用を促進する細胞の物理的な接触を必要とする短距離の細胞コミュニケーション メカニズムです。(信号受信細胞の表面上に存在) Notch 受容体リガンドとの相互作用 (信号送信の表面に細胞) Notch シグナルを開始し、トランスとして知られている-活性化2。その一方で、ノッチと同じセル内とそのリガンドの相互作用のノッチ経路の阻害につながるし、 cisとして知られている-抑制3。トランス- とcisのバランス-相互作用が最適なリガンド依存性 Notch4をシグナルのために必要です。ショウジョウバエは 4 ノッチの受容体と 5 配位子を持つ哺乳類とは異なり (デルタと Serrate) 2 つの配位子 1 つのノッチの受容体を持ちます [ジャグ 1 (JAG1)、JAG2、デルタのような 1 (DLL1) DLL3 および DLL4]5。このシンプルさを持つショウジョウバエモデルはノッチ-リガンド相互作用とその後 Notch シグナル経路の修飾子の効果の分析・研究に使いやすさを提供しています。(ショウジョウバエの翼の開発を含む)、動物の開発時に特定のコンテキストで両方cis- および-適切な Notch シグナルを達成し、運命1,6 セルの相互作用が関与しています。.シス-トランス対にこれらのコンテキストでノッチ経路の修飾子の効果を区別することが重要だ-ノッチとそのリガンドとの相互作用。
当社グループは、ショウジョウバエのノッチにキシロースを否定的と呼ばれる炭水化物残留物の添加が翼開発7を含む、特定のコンテキストで Notch シグナルを調節することを報告しました。シャムスの損失 (酵素、xylosylates ノッチ)「翼の静脈の損失」表現型7に 。最近では、クローン解析と遺伝子投与実験は、シャムスの損失がデルタ介したノッチ名指しを強化することを使用されました。シャムス変異体で強化された Notch シグナルが減少したcisの結果かどうかを区別するために-抑制または増加トランス-活性化、幼虫翅成虫原基におけるノッチ ligands の異所性発現の研究dpp GAL4ドライバーを使用して行われました。これらの実験は証拠を示唆シャムスがトランスを調節することを提供-ノッチcisに影響を与えずにデルタでノッチの活性化-8配位子による抑制。ただし、フィード バック規制と内因性リガンドの作用の異所性発現研究1,6,9の解釈を複雑にします。
ショウジョウバエS2 細胞10を用いて, この問題を解決するには、ノッチ-リガンド相互作用研究11,12の簡単な生体外でシステムが得られます。S2 細胞しない内因性 Notch 受容体とデルタ リガンド11を表現し、鋸歯状の13ノッチ リガンド凝集実験8に影響しない低レベルを表現します。したがって、S2 細胞をノッチおよび/または個々 の配位子 (デルタまたは Serrate) 専ら Notch 受容体またはその配位子の 1 つを表すセルを生成するまたはそれらの組み合わせによって、その安定または一過性を導入することができます。S2 のノッチを表現する細胞の受容体リガンド結合11,12,14を介した血液凝集体の形成に配位子を表現する S2 細胞結果を混ぜてください。集計の形成の定量化は、トランスの測定を提供します-ノッチとその配位子15 (図 1) との結合します。同様に、S2 細胞が cotransfected ノッチとデルタまたは Serrate 配位子とすることができます (すなわち cis-配位子)。Cis-これらのノッチ表現 S2 細胞における配位子はトランスとノッチのバインディングを破棄する-配位子との結果集計形成8,12,14を減少しました。Cisによる会合体形成の相対的な減少-配位子は、 cisの抑制効果の測定を提供します-ノッチとトランス間のバインディングに配位子-配位子 (図 2)。したがって、細胞凝集アッセイが活かされて -トランス・シスの xylosylation の損失の影響を調べるためのノッチとそのリガンドの相互作用。
ここでは、提案する詳細なプロトコル細胞凝集アッセイはトランスとノッチの結合を評価する目的のため-配位子とcisによるその阻害-ショウジョウバエS2 細胞を用いた配位子。例として、我々 はノッチ xylosylation のノッチとトランス間のバインディングへの影響を判断できるようにデータを提供-デルタ8。これらの簡単な試金はノッチ-リガンド相互作用の in vitroの半定量的評価を提供し、ノッチ経路修飾子の生体内での効果発現の分子機構を調べる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1127">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:415px;">BioWhittaker Schneider&#8217;s Drosophila medium, Modified</td>
			<td style="width:187px;">Lonza</td>
			<td style="width:131px;">04-351Q</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution</td>
			<td style="width:187px;">GE Healthcare lifescience&#160;</td>
			<td style="width:131px;">SV30010</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">CELLSTAR 6 well plate</td>
			<td style="width:187px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:131px;">657 160</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">CELLSTAR 24 well plate</td>
			<td style="width:187px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:131px;">662160</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">VWR mini shaker</td>
			<td style="width:187px;">Marshell Sceintific</td>
			<td>12520-956</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Sceintific&#160;</td>
			<td>267110</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">E2311</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">MEGAscrip T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:187px;">Ambion</td>
			<td style="width:131px;">AM1334</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)</td>
			<td style="width:187px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:131px;">R1054</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">VistaVision Inverted microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:415px;">9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software</td>
			<td style="width:187px;">AmScope</td>
			<td style="width:131px;">MU-900</td>
			<td style="width:396px;">Image acquisition using ToupView software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">K210012</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:187px;">GenDepot</td>
			<td style="width:131px;">F0600-050</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Methotrexate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A6770-10</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">HY068-L6</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:415px;">Copper sulphate</td>
			<td style="width:187px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:131px;">4448-02</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2 cells</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">R69007</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">S2-SerrateTom cells</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2-Delta cells</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">152</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2-Notch cells</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">154</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pMT-Delta vector</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">1021</td>
			<td style="width:396px;">Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">pMT-Serrate vector</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pMT-Notch vector</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">1022</td>
			<td style="width:396px;">Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pAc5.1-EGFP</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from Hugo Bellen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:131px;">1611091</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td>Dm02144576_g1&#160;</td>
			<td style="width:396px;">with FAM-MGB dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td>Dm02151827_g1</td>
			<td style="width:396px;">with FAM-MGB dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:131px;">4351405</td>
			<td style="width:396px;">96-well Block module</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell aggregation assays to evaluate the binding of the drosophila notch with trans-ligands and its inhibition by cis-ligands

Notch シグナルは、動物の開発および成人のメンテナンスに幅広く使用されて進化的に保存された細胞間コミュニケーション システムです。隣接セルからのリガンドと Notch 受容体の相互作用を誘導するシグナル伝達経路の活性化 (トランス-活性化)、同じ細胞から配位子との相互作用を阻害するシグナル伝達 (cis-抑制)。トランスとの間の適切なバランス-活性化とcis-抑制は、ノッチは動物の開発時にいくつかのコンテキストにおけるシグナル伝達の最適なレベルを確立するのに役立ちます。ノッチと多くの細胞タイプの有機配位子の重複式ドメインとフィードバック機構の存在のためトランス-シス対に与えられた翻訳後修飾の効果の研究-ノッチの相互作用とその配位子生体内で困難です。ここでは、ノッチのトランスとcis各リガンドへのバインドをノッチ経路修飾子をノックダウンの効果を評価する細胞凝集アッセイでショウジョウバエS2 細胞を使用するためのプロトコルについて述べる。S2 細胞安定または一過性発現するノッチ表現のベクトル (S2 デルタまたは S2 鋸歯) 各ノッチ リガンドを発現する細胞と混在しています。トランス-リガンドと受容体の結合は異型細胞集塊の形成に結果し、成る mL あたりの集計の数の点では測定 &#62; 6 セル。Cisの抑制効果を検討する-配位子、ノッチとそれぞれの ligand の共発現 S2 細胞が S2 デルタまたは S2 鋸歯状細胞混在、集計数は上記のように定量化します。Cisの存在のため集計数の相対的な減少-配位子によりcis-リガンド-トランスの阻害を介した-バインド。これらの簡単な試その配位子にノッチのバインディングの遺伝的または薬理学的操作の効果の半定量的なデータを提供できるし、の生体内で効果の基礎となる分子メカニズムの解明に役立つことができます。Notch シグナルのような操作。

私たちの生体内観察提案、Notch シグナルによる利得の xylosyltransferase 遺伝子のシャムス結果の損失増加デルタ介したトランス-シスに影響を与えずにノッチの活性化-の抑制配位子8ノッチ。この概念をテストするための in vitro細胞凝集アッセイを行った。まず、S2 細胞におけるシャムス発現ノックダウンされた<e...

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Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

-トランス・シスによる活性化と Notch 受容体の阻害の区別が困難な体内システムの複雑さ-配位子、それぞれ。ここでは、トランスにショウジョウバエノッチのバインディングの定性・半定量評価のための in vitro細胞凝集アッセイに基づくプロトコルを提案する-配位子 vs cis-配位子。

セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とCisによるその阻害-配位子

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

cell-aggregation-assays-to-evaluate-binding-drosophila-notch-with

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

7.4K ビュー.  Baylor College of Medicine. -トランス・シスによる活性化と Notch 受容体の阻害の区別が困難な体内システムの複雑さ-配位子、それぞれ。ここでは、トランスにショウジョウバエノッチのバインディングの定性・半定量評価のための in vitro細胞凝集アッセイに基づくプロトコルを提案する-配位子 vs cis-配位子。

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Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

生産と選択的に伝達する一次オリゴデンドロサイト前駆細胞へのレンチを使用するための<em&gt;インビトロ</em&gt;髄鞘形成アッセイ

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

発生生物学

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

の血液細胞集団のアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;幼虫

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

開発<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイは、間葉細胞受けた上皮間葉移行の収縮機能を評価します

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

リンパ腺や血球中を調べるための方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

マウスの破骨細胞前駆体におけるNotchシグナル伝達の刺激

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

三次元レンダリングとカルビンディン抗体、解析人間の胎盤絨毛血管のネットワークを明らかにしました。

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

ショウジョウバエの胚のビーズ無料光ピンセット プローブ細胞力学

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted epithelial morphogen. In this assay, Fog is used as an agonist to activate Rho through a signaling cascade that includes a G-protein-coupled receptor (Mist), a G&#945;12/13 protein (Concertina/Cta), and a PDZ-domain-containing guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF2). Fog signaling results in the rapid and dramatic reorganization of the actin cytoskeleton to form a contractile purse string. Soluble Fog is collected from a stable cell line and applied ectopically to S2R+ cells, leading to morphological changes like apical constriction, a process observed during developmental processes such as gastrulation. This assay is amenable to high-throughput screening and, using RNAi, can facilitate the identification of additional genes involved in this pathway.

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Here we describe a contractility assay using Drosophila S2R+ cells. The application of an exogenous ligand, folded gastrulation (Fog), leads to the activation of the Fog signaling pathway and cellular contractility. This assay can be used to investigate the regulation of cellular contractility proteins in the Fog signaling pathway.

非筋ミオシン II 収縮を介して折り返されている陥シグナル伝達経路ショウジョウバエS2R + 細胞を調査する細胞ベースのアッセイ

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...