細胞内病原体の変異ライブラリースクリーニングおよび転写学研究は、宿主の中で生き残るために使用される目的の病原体のゲノムおよび調節適応に関する重要な質問に答える助けとなる。これらの技術の主な利点は、大規模な調査技術であり、細胞内生命への適応に客観的な洞察を提供することです。これらの技術の意味は、ワクチン療法の潜在的な標的に関する洞察を与えることによって、この疾患に関連するマイコバクテリウム膿瘍の治療に及ぶ。
室温で75平方センチメートルの組織培養フラスコ中のペプトン酵母グルコース培地の30ミリリットルでアメーバアカントアメーバカステラーニ、またはAcを培養することから始めます。1時間後に上清を取り除くために25ミリリットルのピペットを使用し、1回の洗浄ごとに炭素または窒素なしで10ミリリットルのAcバッファーで細胞を3回洗浄します。最後の洗浄後、フラスコの底部からアメーバを1回の激しい揺れで外し、ファルコンチューブの細胞を、新鮮なAcバッファでミル濃度あたり5回10に5時間10回に調整します。
96ウェルプレートで4つのアメーバに5回10をシードします。プレートを32°Cに32度に入れ、揺れることなく1時間置き、浮遊するアメーバの栄養画虫が井戸に付着できるようにします。一方、氷上の細菌を温め、解凍した細菌の5マイクロリットルをインキュベーションの終わりに各ウェルに加えます。
摂氏32度で1.5時間後、フュームフードの下の滅菌された金属トレイの滅菌ガーゼの積み重ねにプレートを反転させて上清を捨てます。1ウェルあたり200マイクロリットルの新鮮なAc培地でそれぞれ3回洗います。最後の洗浄後、アミカシンを1ウェルあたり20マイクロリットルの新鮮培地で共培養し、残りの細胞外マイコバクテリアを2時間排除する。
ちょうど実証したように、新鮮なAc培地で3回のスッシュが続きます。次いで、200マイクロリットルの培地を加え、各ウェルに新鮮なアミカシンを加え、続いて7回の熱不活化大腸菌に10回5倍を加えた。48時間後、1ウェルあたり10%のドデシル硫酸ナトリウム10マイクロリットルで細胞を融解し、摂氏32度で30分間、5%の羊の血液を含むコロンビア寒天プレートに5マイクロリットルのライセートを広げる。
さらに、各滴に25マイクロリットルの無菌水を加えてライセートを希釈する。すべてのライセートがメッキされたら、プラスチックパラフィンフィルムでプレートを密封し、37°Cで3〜4日間培養をインキュベートします。プレートにコロニーが現れたときには、培養物を撮影し、細菌コロニーの数が最も少ない堆積物によって細胞内増殖のために損なわれる変異体を特定する。
細胞内抗酸菌RNA抽出のために、最初にグリセロールとグルコースを添加した7H9培地でM.膿瘍を120RPMで50ミリリットルチューブ中の中指数相に成長させます。培養終了時に、1回1回10ミリリットルのAcバッファーで細菌を2回洗浄し、O.D.600を測定して細菌濃度を推定する。次に、8つのマイコバクテリアに8.5倍の10を加え、新鮮なAc培地の10ミリリットルで6つのアメーバに30°Cと80 RPMで1時間インキュベーションします。
インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を収穫し、同じ遠心分離条件下で洗浄ごとに新鮮なAcバッファーの10ミリリットルで3回ペレットを洗浄する。その後、アミカシンを補充した新鮮なAcバッファーの10ミリリットルで細胞を再中断して細胞外細菌を排除し、摂氏30度と80RPMで4時間培養し、続いて新鮮なAcバッファーで2回のスケを行います。最後の洗浄後、感染したアメーバを4ミリリットルの冷たい溶液3に再び中断し、280マイクロリットルのベータメルカプトエタノールを補い、氷上のアメーバを10分間破壊する。
インキュベーションの終わりに、細胞溶解物を遠心分離して細胞内細菌をペレット化し、細菌ペレットを1ミリリットルの冷水溶液3で再懸濁する。サンプルを作った可能性のあるアメーバRNAまたはプロテアーゼによる汚染を避けるために、すべての上清を除去することが重要です。第2遠心分離で放出された細菌を収穫し、抽出バッファーの1ミリリットルにペレットを再中断します。
その後、マイナス80度で24時間インキュベートします。500マイクロリットルのグラデーションマークまでジルコニウムビーズを含む2つのミリリットルねじ管にマイコバクテリア溶液を移し、RNAシン活性化と細胞溶解を容易にするために、さらに24時間マイナス80°Cでチューブを貯蔵します。分析の日に、氷上のサンプルを解凍し、25秒間6000 RPMで2ラウンドの均質化で細胞をライセ化し、続いて6000 RPMで20秒間均質化した。
均質化の各ラウンドの間に、RNAの分解を避けるために氷上のサンプルを1分間冷却します。第3ラウンドの均質化後、氷上でサンプルを20分間冷却し、各チューブにイソアミルアルコールで希釈したクロロホルム200マイクロリットルを加えます。ボルテックスを1分間ボルテックスし、サンプルを遠心分離し、0.8ミリリットルの冷たいイソプロパノールを水相に加え、2〜3時間の摂氏マイナス20度でインキュベーションします。
インキュベーションの終わりに、再度サンプルを遠心分離し、混合することなく500マイクロリットルの冷たい70%エタノールでペレットを洗浄する。その後、直ちに遠心分離によりエタノールを除去する。遠心濃縮器でペレットを乾燥させる上清を吸引し、100マイクロリットルのDNA/RNAフリー水でペレットを再懸濁します。
実証されているように、筋の入ったMRNA抽出は、栄養源やミネラルの供給源に限られた環境、または低酸素または酸性環境に対応する役割に従って遺伝子をグループ化することにより、誘導および抑圧された遺伝子ファミリーの評価を可能にする。酸化およびニトロス的ストレスに対する耐性において、または環境アメーバに応答する毒性因子の発現において。これらの手順を試みる間、バッチ効果を避けるために、制御された感染したサンプルの培養とRNAの分離を同時に行うことを覚えておくことが重要です。
この手順に従って、二重RNAシーケンシングのような他の方法は、宿主病原体相互作用に関する追加の質問に答えるために前形化することができる。開発後、この技術は、アメーバホストモデルにおけるマイコバクテリア病原性に向けて微生物学の分野の研究者のための道を開いた。手順に記載されている手順に従わない場合、アメーバは嚢胞に変身する可能性があるため、Amoebaeを使用することは非常に危険である可能性があることを忘れないでください。
