Name: spectral reflectometric microscopy on myelinated axons in situ
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
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この作品は、によって、研究所の基礎科学 (IBS R015 D1)、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 文部省 (2017R1A6A1A03015642) によって資金を供給にサポートされていました。

すべての手術は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 成均館大学によって承認されました。
1. サンプル準備
注: オートクレーブ動物処理前にすべての手術器械。手術専用ルームですべての手術のパフォーマンスを実施します。滅菌ガウンと手袋は、すべての回で手術室のすべてのスタッフが着用する必要があります。
<ol><li>
ティッシュの固定
	<ol>
<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 4% パラホルムアルデヒド (PFA) PBS で満ちている各 10 mL 注射器 2 本を準備します。</li>
		<li>7 12 週齢のマウス, (c57bl/6 j またはどちらかの性別を任意のマウス線) zoletil とキシラジン (1:1、20 mg/kg) または、代替の適切な麻酔体制 (例えば、ケタミン 80 mg/kg および 10 mg/kg の混合物の混合物を投与することで麻酔します。キシラジン) 腹腔内注入。</li>
		<li>マウスは手術麻酔 (つま先ピンチ応答メソッドを使用して) 面に達したら、はさみで皮膚と胸郭を切り落とすことにより心を公開します。</li>
		<li>血液を抜くし、針で左心室を順次 PBS と PFA ソリューションを灌流する小さいハサミで右房を切り取る (灌流率 = 4 mL/分、ボリューム 10 mL の各ソリューションのための =)。 注: マウスは、手順が正常に完了した場合は堅くなります。眼軟膏や消毒の使用はプロシージャがターミナルは必要ではありません。固定プロシージャをスキップことがあります。ただし、機械的組織の損傷や虚血性軸索腫大を含む構造の変形を最小限に抑えるには、この手順の使用をお勧めします。ティッシュの固定については、ゲージ、G. J.らによる記事を参照してください。10
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
脳スライスの準備
	<ol>
<li>腹胸部と腹部を手術用はさみでマウスの首をはねます。</li>
		<li>頭皮と頭蓋骨を完全に公開するまで適当に小さなはさみを使用して骨膜を削除します。</li>
		<li>前頭骨を打破し、脳に損傷を与えないように注意して小さなはさみを使用して後頭骨の矢状縫合に沿って頭蓋骨を切断します。</li>
		<li>頭蓋と順次微細鉗子を用いた硬膜を慎重に取り外します。</li>
		<li>組織を損傷しないように注意を取って、柔らかいプラスチック スプーンを使用して脳を抽出します。</li>
		<li>リンス、4 ° C で 30 分間 4 %pfa 溶液で抽出した脳を浸す</li>
		<li>Vibratome を使用して 100-150 μ m のセクションに固定脳をスライスします。 注: ティッシュの準備の詳細についてを参照してください記事 Segevらによって11します。 以降の手順では、組織する必要がありますスライスされるセクションにスペーサーの厚さより薄く。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
脳スライスの取り付け
	<ol>
<li>組織スライスごとにスライド 1 ガラスと 2 正方形カバー メガネ (22 × 22 × 0.17 mm) を準備します。</li>
		<li>半分にカット正方形カバー メガネの 1 つ (2 つの長方形の部分) ガラス カッターを使用しています。</li>
		<li>スライド グラス上でスーパー接着剤を使用して半分のカバー メガネの 2 つを接続します。 注: 2 つの半分ガラスの間のスペースは組織スライスのサイズより少し大きいはずです。</li>
		<li>ブラシやピペットを使用して脳スライスを収穫し、スペーサーの間には、スライド ガラス上の組織を置きます。組織を折るように注意してください。</li>
		<li>組織表面上の PBS 100 μ L を分注します。</li>
		<li>ティッシュの上に、正方形カバー ガラスを配置します。この段階で気泡を含めることを避けてください。</li>
		<li>後続のイメージング セッション中にほこりが PBS の蒸発や汚染を防ぐために爪のポーランド語 (または代わりに適切な接着剤) を使用カバー ガラス周りにシールします。 注: この段階で実験者が一時停止します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 校正
<ol><li>顕微鏡、少なくとも 1 h に切り替える前にレーザーの熱安定化できるようにイメージング ソース (材料の表を参照してください)。次に、スペクトル スキャン (材料の表を参照してください) のソフトウェアを有効にし、GUI (図 3 a).の上部にある [取得] ボタンをクリックしてください
</li>
	<li>白色光レーザー (WLL) および光電子増倍管 (PMT) (図 3 a) ソフトウェア シャッターをオンにします。</li>
	<li>アクイジション ・ モードでドロップダウン リストにxyΛ モードを選択し、定数 %から一定の電源をレーザーの入力モードを自動的に変更します。SP の自動巻きムーブメントのチェック ボックスをオフにします。470-670 nm と 4 スペクトル ステップ サイズを入力レーザのスペクトル ウィンドウを設定し、そしてΛの nm-励起ラムダ スキャンの設定(図 3 b)。</li>
	<li>ダブルクリックするか (図 3 c) のスペクトル範囲の調整バーを動かす 450 690 に光電子増倍管のスペクトル範囲を設定します。 注: このスペクトルの範囲は、入力ソースの完全な帯域幅を含める必要があります。</li>
	<li>高開口数を適切に、水浸対物レンズを選択 (NA > 0.7) とAOBS 構成とライブ スキャンボタンをアクティブに PMT とレーザーの電源を任意の値を与えます。AOBS 構成(図 3 d) の反射をチェックすることによって光路を切り替えます。</li>
	<li>参照ミラーをマウント (材料表参照) 顕微鏡ステージ上。鏡面は、対物レンズに対して直面する必要があります。場合顕微鏡ステージにミラーを置きやすい、フラット プレート (スライド ガラスなど) の上にミラーを接着します。</li>
	<li>ミラー表面に焦点面を揃えるに顕微鏡ステージを制御します。</li>
	<li>光電子増倍管の利得と検出器のダイナミック レンジを考慮したレーザー パワーを調整し、一定の電源を一定パーセントからレーザーの入力モードを変更します。 注: 典型的なよう、PMT ゲイン 500 (V) と 0.1% の相対的なレーザー出力は 570 で使用される nm。</li>
	<li>波長範囲にわたって彩度がないことを確認する擬似カラー モードで確認します。彩度を観察すると、(図 3 a) のレーザー出力を下げます。</li>
	<li>ラムダ スキャン取得を実行します。</li>
	<li>ステージからミラーを削除し、暗い参照 (すなわち、暗いオフセット) を取得するためにサンプルなし同じ取得を繰り返します。</li>
	<li>研究 TIF形式でデータを保存します。</li>
</ol>3. スピア画像集録
<ol><li>顕微鏡ステージ上にマウントされた組織を置いてください。対物レンズの焦点平面に組織をほぼ揃えて配置するには、目の部分を広視野蛍光モードを使用します。</li>
	<li>ライブ スキャンで、組織の関心領域に焦点面を揃えるに顕微鏡ステージを制御します。カバー スリップからのバック グラウンド ノイズを避けるためには、ガラス組織インターフェイスから少なくとも 15 μ m の深さのターゲット地域を選択します。</li>
	<li>手順 2.1-2.10 で同じ手順を使用してターゲット領域のスペクトル画像のスタックを取得します。</li>
	<li>研究 TIF形式で組織と暗いオフセットのデータを保存します。 注: この段階で実験者が一時停止します。</li>
</ol>4. 画像処理と解析
<ol><li>ImageJ で参照ミラーおよび脳組織のスペクトル データ (研究 TIF) を開きます。</li>
	<li>開かれた画像のスタック ・ ロワ (興味の地域) を選択、参照ミラーと脳組織の軸索繊維のセグメントの中心部。</li>
	<li>実行イメージ→スタックで選択した Roi の生のスペクトルを取得 ImageJ メニュー上のz 軸のプロットのプロファイル。</li>
	<li>暗いのオフセット データ参照ミラー、他に行われ、脳の組織のための 1 つを開きます。</li>
	<li>実行中のイメージ→スタック→ 暗いオフセットのスペクトルを取得 ImageJ メニュー上のz 軸のプロットのプロファイル。</li>
	<li>コピーと貼り付けのオプションを使用して取得したすべてのスペクトルを保存します。 注: 領域イメージング用軸外収差を最小限に抑えるために中央のイメージング分野の使用お勧めします。軸索線維は、その長さに沿って構造的に異機種混在可能性があります。したがって、小さい軸索のセグメントに ROI を選択すると、通常 < 5 μ m、部分的なボリューム アーティファクトを最小限に抑えることを推奨します。</li>
</ol>5. 基線補正、スピア信号解析
<ol><li>参照ミラーや脳組織のスペクトルからスペクトルのオフセットを減算します。</li>
	<li>各スペクトルのスペクトルの最大強度で割って正規化します。</li>
	<li>参照ミラーの正規化されたスペクトルによる軸索の正規化されたスペクトルを分割し、正規化されたスペクトルから DC オフセットを減算します。</li>
	<li>正弦波を集録したスペクトルをあてはめによる波の周波数を測定 (材料の表を参照)、曲線し、周期に取って逆数による買収の波数を変換します。</li>
	<li>波数の周期性を図 4 の cの式を使用して軸索直径に変換します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath.">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li><li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction.">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li><li>Shim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li><li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices.">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li><li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system?.">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?.</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li><li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath.">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo.">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832 (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024 (2016).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li><li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li></ol>

著者は、競合する金銭的な利益を宣言: J. クォンと M. チェは、この資料に記載されている保留中の特許技術の発明者。

スピアはスペクトル干渉法による、初めてのライブの有髄軸索のナノスケール情報を提供する新しいラベル無料画像モダリティです。現在獲得プロトコルで軸索直径の空間分解能が 10 nm。また、スピア利用; 他の超解像顕微鏡と比較して桁の低光量したがって、光毒性とフォトブリーチを行なったから無料です。スピアは、有髄軸索のナノスケール動態を研究するための新しい道を提供しま?...

哺乳類の神経系のミエリンは enwrapping 多層膜鞘と軸索線維によって急速な神経伝導と軸索の整合性を提供します。多層構造が細胞膜から成るなナノスケール薄膜を交互で構成される (〜 5 nm)、細胞質 (~ 3 nm)、および細胞外スペース (〜 7 nm)1,2。最近超解像顕微鏡などの光学顕微鏡は光の回折3,4、5のための不十分な解像度のためのナノスケール ミエリンの動態を観察するため適していません。電子顕微鏡は、ミエリン ナノ構造の細部を提供できますが、生物系化学固定法と ultrasectioning67,を含む高度侵襲的なサンプルの準備のために互換性がないです。.最近までなかった技術適用有髄軸索原のナノスケール動態を観察します。
Schainらは、有髄軸索がカラフルな光の反射率8を示すことを報告しました。反射光の分光分析を採用し、我々 はスペクトル反射 (領域)9の名前の有髄軸索のナノスケール イメージングのための新しいイメージング法を考案しました。領域は、髄鞘 (図 1) の多層構造で発生する薄膜干渉に基づいています。様々 な軸索の光学シミュレーションによる我々 は反射率スペクトル波数とその周期の周期関数であることを明らかにしている (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">) は軸索の直径 (d) に反比例します。この簡単な関係 (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) 領域データから軸索直径の安易な定量化を提供しています。これを利用して、私たちは私たちの前のレポートで軽度外傷性脳損傷の下で膨らんだ流行している軸索を明らかにしました。
スピア システム共焦点顕微鏡に基づいて成っている特殊な光源とフィルター (図 2)。入力ソースがホワイト ライト レーザー, 広帯域スペクトル出力赤外領域に表示を提供することです。2 つの音響光学素子のスペクトル スキャン、システムが搭載されて: 入力広帯域光源と音響光ビームスプリッター (AOBS) から選択した波長を提供して反映選択を導くための音響光学波長可変フィルター (AOTF)検出器波長。ハイパー共焦点の顕微鏡検査のためソフトウェアは、さまざまな入力波長における反射率画像を順次取得するカスタマイズ可能なスペクトル スキャン オプションを提供します (材料の表を参照してください)。さらに、色収差は批判的にスペクトル測定に干渉することがしたがって、アポクロマート対物レンズの使用をお勧めします。
注記のうち、白色光レーザー出力不均一なスペクトルと光学部品もスペクトルのプロファイルに影響を与えます。したがって、得られたスペクトルは後続の定量分析用のキャリブレーションする必要があります。保護されたシルバー ミラーは通常、完全可視領域にほぼ一定の反射 (> 97%) を提供する参照として使用されます。得られたスペクトルは、ミラーからの参照スペクトルで、分かれています。
スペクトル スキャン スペクトル ステップ サイズ決定集録速度;したがって、それを最適化する必要があります。大きい軸索が高いスペクトル期間、細かいスペクトル サンプリングが必要です。例えば、直径 10 μ m、最大の生理学的な軸索の 1 つの軸索はスペクトル期間 〜 8 nm。4 のスペクトル サンプリング間隔を用いてナイキスト サンプリング条件を適用すると、マウス神経系における生理学的神経軸索をカバーする nm。このアプローチは完全スペクトル スキャンに数秒以上かかります、従っていないアプリケーションに適しています生体内で、生理学的運動 (例えば呼吸・心拍) が安定したスペクトル取得を妨害します。私たちは以前配列分析計 (集録速度 ≒ ピクセルあたり 30 ms) を使用して各ポイントの完全なスペクトルを取得するように設計、カスタマイズされた正立顕微鏡をインストルメント化することによってこの問題を解決しました。
このレポートでは、商業ハイパー スペクトル顕微鏡で行うことができる固定脳スライスの領域イメージングに関する詳細なプロトコルについて述べる (材料の表を参照してください)。したがって、プロトコルは、光計測の専門知識のない実験者で完了ことができます。私たちはまた、潜在的な問題および領域データの取得と解析のトラブルシューティングをカバーします。

<table><tbody><tr><td>Glass cutter</td><td>-</td><td>-</td><td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>-</td><td>-</td><td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td></tr><tr><td>Apochromat objective 40&amp;times;, NA 1.1</td><td>Leica Microsystems</td><td>15506357</td><td>Water-immersion type</td></tr><tr><td>Fluoromyelin Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>F34651</td><td>Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.</td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td><td>Refer to the &quot;Configuration of microscope&quot; in Introduction Section for details.</td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-X</td><td>-</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>Coated with protected silver.</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136</td><td>-</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Biosolution</td><td>BP031a</td><td>4% v/v in PBS</td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Thermo Fisher</td><td>3306</td><td>Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)</td></tr><tr><td>Slide glass</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>5116-20F</td><td>Thickness: ~1 mm</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Henkel</td><td>Loctite 406</td><td>Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Brainetree Scientific</td><td>BS-8000 DUAL</td><td>-</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200S</td><td>-</td></tr><tr><td>White-light laser</td><td>NKT photonics</td><td>EXB-6</td><td>EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.</td></tr></tbody></table>

spectral reflectometric microscopy on myelinated axons in situ

哺乳類の神経系ミエリンは多層スパイラル軸索線維の enwrapping で電気絶縁を提供します。その度に編成されて細胞内建築に触発され、我々 は最近という名前のスペクトル反射 (領域)、原ライブ有髄軸索の前例のないラベル無料ナノスケール イメージングを可能にする新しいイメージング法を開発しました。基本原理は、多層の細胞レベル下の構造の反射スペクトルを分析することによりナノ構造情報を得ることです。この記事で商業共焦点顕微鏡システム、白色光レーザーと波長可変フィルターを用いた神経組織の基本的な領域イメージングを実行するための詳細なステップバイ ステップ プロトコルについて述べる。スペクトル データ、およびナノ構造の情報を得るための画像処理による試料作製の手順を紹介します。

外因性の染色、ミエリンを対象とした蛍光を持つ準備された固定脳スライス プロトコルに従って (材料の表を参照してください)。と共に使用して商業ハイパー共焦点顕微鏡共焦点蛍光イメージング (図 4 a) 脳スライスの領域イメージングを行った。スピア、入力光強度が 5 μ/μ m2 〜 1 μ s の画素のドウェル時間を設定しまし?...

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Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

その場で有髄軸索のスペクトル反射型顕微鏡

イメージング分光反射率に基づくラベル無料ナノを使用して固定脳スライスの髄軸索をイメージングのためのステップバイ ステップ プロトコルを紹介します。

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

7.3K ビュー.  Sungkyunkwan University. イメージング分光反射率に基づくラベル無料ナノを使用して固定脳スライスの髄軸索をイメージングのためのステップバイ ステップ プロトコルを紹介します。

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Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

ヤツメウナギ網様体軸索の急性解離は、個別の機能シナプス前終末のリリース顔膜から録音を有効にする方法

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

神経科学

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

アン<em&gt;エクスビボ</em&gt;レーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

リゾレシチンの焦点注入による実験的脱髄およびマウス脊髄の再ミエリン化

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

インビボ で2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

生物工学

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

準備や髄脊髄小脳スライス培養の免疫染色

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy (3D-SIM)

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to the maintenance of neuronal polarity by sorting somato-dendritic cargo. A membrane periodic skeleton (MPS) comprising periodic actin rings provides a scaffold for anchoring various AIS proteins, including structural proteins and different ion channels. Although recent proteomic approaches have identified a considerable number of novel AIS components, details of the structure of the MPS and the roles of its individual components are lacking. The distance between individual actin rings in the MPS (~190 nm) necessitates the employment of super-resolution microscopy techniques to resolve the structural details of the MPS. This protocol describes a method for using cultured rat hippocampal neurons to examine the precise localization of an AIS protein in the MPS relative to sub-membranous actin rings using 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM). In addition, an analytical approach to quantitively assess the periodicity of individual components and their position relative to actin rings is also described.

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy 3D-SIM

The present protocol describes a method to visualize and measure actin rings and other components of the membrane periodic skeleton of the axon initial segment using cultured rat hippocampal neurons and 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM).

3D構造化照明顕微鏡(3D-SIM)を用いた軸索初期セグメントの膜周期骨格の特性の測定

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

コヒーレントアンチストークスラマン分光法(CARS)による脳スライスの髄鞘形成イメージングへの応用

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

その場で有髄軸索のスペクトル反射型顕微鏡

要約

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ヤツメウナギ網様体軸索の急性解離は、個別の機能シナプス前終末のリリース顔膜から録音を有効にする方法

アン

リゾレシチンの焦点注入による実験的脱髄およびマウス脊髄の再ミエリン化

モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化

インビボで2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング

準備や髄脊髄小脳スライス培養の免疫染色

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

3D構造化照明顕微鏡(3D-SIM)を用いた軸索初期セグメントの膜周期骨格の特性の測定

コヒーレントアンチストークスラマン分光法(CARS)による脳スライスの髄鞘形成イメージングへの応用

その場で有髄軸索のスペクトル反射型顕微鏡

要約

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ヤツメウナギ網様体軸索の急性解離は、個別の機能シナプス前終末のリリース顔膜から録音を有効にする方法

アン

リゾレシチンの焦点注入による実験的脱髄およびマウス脊髄の再ミエリン化

モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化

インビボ で2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング

準備や髄脊髄小脳スライス培養の免疫染色

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

3D構造化照明顕微鏡(3D-SIM)を用いた軸索初期セグメントの膜周期骨格の特性の測定

コヒーレントアンチストークスラマン分光法(CARS)による脳スライスの髄鞘形成イメージングへの応用

インビボで2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング