誘導されたモノクローナル抗体は、主に診断用治療用免疫試薬に使用され、限られた生産で安定で信頼性の高い抗体を産生する必要性を強調しています。ここで説明した方法は、組換え抗体の生産がモノクローナル抗体の生産効率を高め、人件費と時間に関連するコストを最小限に抑えることができることを証明しました。これらの方法は、アミノペプチダーゼおよび抗体ベースの抗体薬物複合体およびその他の治療製品の開発に使用され、細菌およびウイルス感染の予防および治療におけるAPNの役割を明らかにするのに役立ちます。
手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるYan Liです。まず、選択した成体雌マウスに100マイクログラムのAPNタンパク質を腹腔内注射して、最終的な抗原ブーストを行います。3日間の注射後、マウスから脾臓を採取し、DMEMで2回洗浄して血液と脂肪細胞を除去します。
200メッシュの銅グリッドを使用して脾臓細胞懸濁液をろ過して組織の破片を取り除き、遠心分離を使用して脾臓細胞を採取して脾臓膜を除去します。マウスSP20骨髄腫細胞を、6%ウシ胎児血清を添加した5ミリリットルのDMEMを含む25平方センチメートルのフラスコに播種し、細胞生存率を維持するために摂氏37度、二酸化炭素6%の雰囲気で細胞を培養します。5〜6日間の培養後、細胞は蘇生後に80〜90%のコンフルエンスに達し、顕微鏡下で丸く、明るく、透明に見えるはずです。
ハイブリダイゼーションの前日に、マウスの腹腔からマクロファージを採取する。腹膜マクロファージを1ミリリットルあたり10〜5倍の0.1〜0.2倍の密度で、それぞれ100マイクロリットルのHAT培地を含む96ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートします。ハイブリダイゼーションのために、SP20細胞を8〜10本のピペットで穏やかに吸引し、10ミリリットルの無血清DMEM培地に懸濁します。
細胞を新鮮なDMEMで洗浄し、2回遠心分離してから、10ミリリットルのDMEMに再懸濁します。定量した脾臓細胞とSB20細胞を10:1の比率で混合し、50ミリリットルのチューブに移します。遠心分離後、上清を捨て、チューブの底にペレットを集めます。
チューブをタップして、ハイブリダイゼーションの前にペレットを緩めます。スポイトを使用して、チューブの底を穏やかに回転させながら、緩んだセルペレットに摂氏37度に予熱したポリエチレングリコール1500を1ミリリットル加えます。次に、摂氏37度に予熱した1ミリリットルのDMEMを混合物に90秒間ゆっくりと加え、続いてさらに30ミリリットルの新しいDMEMを加え、融合管を摂氏37度の水浴に30分間入れます。
インキュベーション後、細胞を収穫します。HAT培地を再懸濁し、腹膜マクロファージを接種した96ウェルプレートに培養します。5日後、100マイクロリットルの新鮮なHAT培地を各ウェルに加えます。
そして再び5日間のインキュベーションの後、培地をHAT培地と交換する。0.05モルPBSで希釈した5マイクログラム/ミリリットルのAPNタンパク質でコーティングしたマイクロタイタープレートを使用して、ELISAアッセイを使用してハイブリドーマ上清中のモノクローナル抗体を分析します。pET28aと組換え抗体アミノペプチダーゼNBL21形質転換細菌を、0.4ミリモルのβ-d-1-チオガラクトピラノシドの存在下で、摂氏37度のオービタルシェーカーで10時間増殖させます。
ウェルあたり100マイクロリットルの0.5倍10〜5番目のチャイニーズハムスター卵巣細胞を96ウェルプレートに播種し、摂氏37度、6%二酸化炭素雰囲気で18〜24時間インキュベートします。細胞が80〜90%コンフルエントに達したら、pIRES2-zs Green 1組換え抗体アミノペプチダーゼおよびプラスミドをOpti-MEMで最終濃度0.1マイクログラム/マイクロリットルに希釈します。5分後、50マイクロリットルの希釈pIRES2-zsグリーン1組換え抗体アミノペプチダーゼおよびプラスミドを1マイクロリットルのリポフェクタミン2000および49マイクロリットルのOpti-MEMと混合する。
20分間のインキュベーション後、CHO細胞を含む96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの混合物を加える。トランスフェクション後4〜6時間で、10%FBSを添加したDMEM F12で培地を交換します。48時間のインキュベーション後、各ウェルに400マイクログラム/マイクロリットルのG418を添加し、安定にトランスフェクトされた細胞を選択します。
10%FBSおよび400マイクログラム当たりマイクロリットルG418を添加したDMEM F12培地を用いて10日間選択した後、蛍光活性化細胞選別で細胞を選別する。採取した陽性細胞を順次希釈する。96ウェルプレートにウェルあたり平均0.5〜2細胞で播種し、摂氏37度、6%二酸化炭素インキュベーターで培養します。
代表的な顕微鏡分析では、すべてのハイブリドーマ細胞が丸く、明るく、透明に見えました。重い50キロダルトン鎖と軽い25キロダルトンの鎖を有する精製モノクローナル抗体をSDS-PAGEで確認し、精製腹水中に見出した。培養上清および腹水中におけるこれらの抗APNモノクローナル抗体の力価をここに示す。
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングにより、クローン5B31、5B36、3C48、5C51、および6C56に由来する抗体は免疫グロブリンG2Bサブクラスを有し、APN 2A20は免疫グロブリンG2Aカッパ型抗体であり、モノクローナル抗体APN 3FD9、3F10、および10F3は免疫グロブリンM型および加工されたカッパ軽鎖に属することが明らかになりました。これらのモノクローナル抗体のほとんどは、APNの異なるエピトープを標的としているのに対し、APN 5C51抗体はAPN 3C48、5B31、および6C56モノクローナル抗体によって認識されるような抗原エピトープを認識していることを示す50%を超えるAV値を示しました。増幅したAPN 5B36 VHVL遺伝子をpET28a陽性またはpIRES2-zsグリーン一ベクターにライゲーションし、pET28a陽性RABS APNおよびpIRES2-zsグリーン一RABS APNの組換え発現プラスミドをそれぞれ構築した。
pET28aと組換え抗体アミノペプチダーゼNBL21およびpIRES2-zsグリーン一組換え抗体アミノペプチダーゼNCHO細胞の両方によって発現された抗体を精製し、ELISAおよびIFAアッセイを用いて分析した。しかし、pIRES2-zsグリーン一組換え抗体アミノペプチダーゼNCO細胞の上清で発現した抗体のみがAPNタンパク質を認識する。APN 5B36モノクローナル抗体のAPNタンパク質への結合は、組換え抗体よりも早く平衡に達した。
プロテインAアガロースを用いた上清中のモノクローナル抗体の精製は、飽和硫酸アンモニア沈殿を用いるよりも優れている。
