Name: laboratory scale production and purification of a therapeutic antibody
Uploaded: 2017-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
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The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954; was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954;.

注：適切な哺乳動物発現ベクターは、このプロトコルを使用する必要があります。ここでは、2つの発現カセットを含有する単一の構築物が使用される（ すなわち、重鎖および軽鎖の発現は別個のプロモーターによって駆動されます）。トラスツズマブ重鎖および軽鎖は、以前にベクターにクローニングしました。このベクターは、非営利のプラスミドリポジトリ13を経て得られたアンドリューBeavilからの贈り物でした。 1.回復とベクターDNAのスケールアップ注：ベクターDNAは、 大腸菌 XL-1ブルー株における軟寒天穿刺培養として受信されました。ベクターは、ハイグロマイシン耐性を運びます。 <ol><li>ストリーク単離コロニー/ mlのハイグロマイシン75μgので調製したルリア・ベルターニ（LB）寒天プレートその後、穿刺培養のソフト寒天に、無菌接種刺しやループを挿入します。 18-24時間、37℃でプレートをインキュベートします。 </li><li> 75 / mlのハイグロマイシンを含む5ミリリットルのTerrificブロス（TB）にシングルコロニーを接種します。 Incu225rpmで振盪しながら18-24時間、37℃でお譲り文化。 </li><li>優しくクライオバイアルに200μlの80％グリセロールで文化の800μLを混合することにより、ベクターDNAのグリセロールストックを準備し、-80℃で凍結する一晩培養を使用してください。 <ol><li>バッフル振とうフラスコ（ すなわち、1 /千希釈）で75 / mlのハイグロマイシンを含む100 mlのTBの一晩培養物100μlを加えます。 225rpmで振盪しながら18-24時間、37℃で培養をインキュベートします。 </li></ol></li><li>一晩培養した後、抽出し、以下の例外を除いて、MIDI /マキシ調製キットの製造業者の説明書に従ってDNAを精製。水（pHは7.0〜8.5）で最終工程、溶出または再懸濁DNA中。 </li><li>その後、-20℃でDNAを保存260および280nmでの濃度と吸光度の測定値によるDNAの純度を確認してください。 注：オプション（推奨）：身元を確認するために、ベクター特異的プライマーを用いて配列DNA。 </li></ol> 2。 HEK-293細胞の安定なトランスフェクション<ol><li>エルレンマイヤーフラスコ中の0.1％の非イオン性界面活性剤を補充した無血清培地中で標準的なプロトコールに従ってHEK-293細胞（浮遊細胞）の成長、維持。 2×10 5細胞/ mlとサブカルチャー4日毎に維持します。 5％CO 2および120rpmで回転しながら37℃で培養細胞。 注：トランスフェクション前に細胞なし4未満日間培養されている必要がありますし、これ以上の4週間。血清含有培地中で単層として増殖させたHEK-293細胞は、この手順のために使用することができます。 </li><li>トランスフェクション前の日に、種子HEK-293 10％の熱不活性化ウシ胎児血清（を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）2mlの12ウェルプレートのウェル中に3×10 5細胞/ mlの細胞FBS）。トランスフェクションの日に、細胞が80〜90％の密集度に達したことを確認してください</li><li>その後、一緒に混ぜてトランスフェクション培地で別々にDNAおよびポリエチレンイミン（PEI）を希釈します。<ol><li> 300μlのトランスフェクション培地にウェルあたり1.25μgのベクターDNA（12ウェルについては15μg）を希釈します。 5分間、室温でインキュベートします。 </li><li> 300μlのトランスフェクション培地中：; 1mg / mlのPEI溶液2.5μlの（PEIへのDNAの2比すなわち 1 12ウェルについての30μl）を希釈します。 5分間、室温でインキュベートします。 </li><li>穏やかに混合し、15分間室温でインキュベートし、希釈したPEIに希釈されたDNAを追加します。 </li></ol></li><li>プレートの各ウェルにDNA / PEI混合物の滴下の50μLを加えます。 24時間37℃、5％CO 2でのトランスフェクション混合物は、次いで、プレートを置く配布する優しく板岩。 </li><li>ウェルBハイグロマイシン、10日間、37℃、5％CO 2にプレートを戻すML /50μgのを追加。 注：10日目では、非トランスフェクトされた細胞は死んだと切り離さプレートの表面から、安定的にトランスフェクト細胞が生存可能となり、一方、プレートに取り付けられています。 </li><li>を含むウェル内のメディアを交換します1/4体積の無血清培地と3/4の体積のDMEM 10％FBSを補充した（ すなわち 0.5ミリリットルの無血清培地+ 1.5ミリリットルDMEM = 7.5％の最終血清濃度）と4日間インキュベートします。 </li><li> 10％FBS（+ 1ミリリットルDMEM = 5％の最終血清濃度すなわち 1ミリリットルの無血清培地）を補充した1/2容量の無血清培地および1/2容量のDMEMでウェル中の培地を交換し、4日間インキュベートします。 </li><li> 10％FBS（ すなわち 1.5ミリリットルの無血清培地+ 0.5ミリリットルDMEM = 2.5％の最終血清濃度）を補充した3/4の体積の無血清培地と1/4の体積DMEMでウェル中の培地を交換し、4日間インキュベートします。 </li><li> 0.1％の非イオン性界面活性剤（すなわち、0％の最終血清濃度）を補充した無血清培地の2ミリリットルでウェル中の培地を交換し、4日間インキュベートします。 注：無血清適応の間に細胞に50μg/ mlのハイグロマイシンB選択圧を維持します。無血清培地に適応した細胞をウェルの表面から切り離し、私をクラスタ化することができますn個のサスペンション。 50μgの追加のサプリメントと培養条件のために2.1をステップを参照してください/ Bをmlハイグロマイシン</li><li>ピペットを用いて、静かに別のチューブに12ウェルプレート、プール細胞中の懸濁培養物を混ぜます。 <ol><li>血球計数器を用いて、2×10 5細胞/ mlの三角フラスコ中で30 mlの無血清培地にプールの細胞および種子を列挙する。 5％CO 2および120rpmで回転しながら37℃で培養細胞。 4日ごとに継代培養し、展開します。 </li></ol></li><li>液体窒素中で凍結保存のための1×10 7細胞/バイアルで10バイアルを得るために必要な細胞密度まで培養サイズを拡大し続けます。 10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含有する無血清培地中の細胞を凍結します。 注：抗体を含有する馴化培地は、タンパク質産生を確認するために、それぞれの継代培養で回収または精製条件を最適化するために使用することができます。馴化培地を収穫し、継代培養のための細胞を維持、で培養物を遠心分離します5分間300×gでは、その後のフィルター滅菌上清を0.22μmのフィルターを通して。濾過した上清を、1〜2週間、または長期保存のために-20℃、4℃に保持することができます。 </li></ol>バッチ生い茂る文化から3.大規模抗体産生注：抗体産生は、既存のセルがセットアップされるために、バッチ過剰に増殖培養容量に基づいて、必要な細胞密度に展開されているステップ2.11からに追跡することができます。そうでない場合は、凍結保存から解凍された細胞は、一旦、適切な細胞密度および体積に膨張し、この段階で始まります。様々な培養サプリメントは、抗体産生を最適化するために使用されてもよいです。抗体の収量を増加させるトリプトンの使用は、このプロトコルで示されています。 <ol><li>種子細胞は、2つの三角フラスコ中の100mlの無血清培地中で2×10 5細胞/ mlで（補充-未及び栄養補充した培養物からの抗体の収率を比較します）。 37での文化 °C、5％CO 2 </sUB&gt;および120 rpmで。 </li><li> 24時間後、栄養添加した培養に最終濃度0.5％にトリプトンを追加します。無血清培地で未添加した培養の音量を均等化。 </li><li> 8日目から、細胞生存率を監視するために、血球計数器を用いて毎日培養物の細胞数を実行します。細胞生存率が80％未満になると、培養上清を収穫。 <ol><li> 15分間、3000×gでの培養物の遠心分離により収穫上清その後のフィルター滅菌（抗体を含む）上清を0.22μmのフィルターを通して。 4°C（短期）で上清を保存したり、-20℃（長期）で凍結。 </li></ol></li></ol>自動化された高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）システムを用いたアフィニティークロマトグラフィー4.抗体精製注：以下の手順は、一般に、ほとんどの自動化システムにも適用することができます。精製は、室温または4℃（FPLCシステムを冷却室に保管されている場合）で行うことができます。スカウト一連の試験は（結果の項を参照）馴化培地から精製した抗体の最大の回収を確実にするために、バッファ、溶出緩衝液及びpH結合、適切なカラムマトリックスなどの最適な精製条件を同定することができます。最適な条件は、精製された抗体またはタンパク質に依存しています。精製は、自動化されたFPLCシステムで行いました。精製を、5mlのプロテ​​インAカラムを用いて室温で行いました。 <ol><li>超純水を使用して、以下の緩衝液を準備した後、0.22μmのフィルターでろ過推奨pHに調整します。 <ol><li> 0.14 MのNaCl、0.0027 MのKCl、0.01 MのNa 2 HPO 4および0.001 M KH 2 PO 4：以下を混合することにより、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.4（結合緩衝液）の1 Lを用意。必要に応じてバッファをフィルタリングする前にpHを調整します。 </li><li> 0.1Mグリシン - 塩酸pHは2.7（溶出バッファー）の500ミリリットルを準備します。バフをフィルタリングする前にpHを調整しますえー。 </li><li> 1 MトリスpHは9.0（中和緩衝液）の50ミリリットルを準備します。 </li></ol></li><li>コンピュータとすべてのシステム電源と通信接続が行われていることを確認します。デバイスは、ソフトウェア「システムコントロール」モジュールで表示されるはずです。確保UVセルは、280 nmの波長に設定されています。オプション：接続して使用する場合にはpH計を校正。 </li><li>システムを洗浄するために超純水でA、B及び試料ポンプの入口管を浸します。チューブ内の空気またはシステム内の空気の疑いがある場合、注射器でポンプをパージします。システムコントローラを介して、または自動化された方法を介して手動操作により水を使用してシステムを洗ってください。その圧力、導電率、UV 280トレースとpHは一貫性を維持し、カラムの圧力限界は、メーカーの仕様通りに超えていないことを確認します。 注：異常が先に進む前に対処する必要があり、システム内の空気や閉塞を示すことができます。 </li><li>システムコントローラモジュールでは、1で流量を開始ml /分を手動でいずれかの負荷のポンプAを経由して（サンプルループをバイパスして）または列を接続を開始する位置（サンプルループを介して）注入します。外し、システムの列位置の入口のチューブとカラム入口に接続されたストッパーを外します。 <ol><li>水は、列にシステムのチューブを取り付ける柱の上にシステム・チューブ滴下から流れることを可能にします。カラム入口を有し、水の滴で溢れフィッティング入口は、気泡のない接続を保証します。 </li></ol></li><li>下流の出口でカラムの出口を取り付け、すべてのフィッティングがしっかりと固定されていることを確認します。列仕様で概説されるようになりましたシステムに接続されている列で、最大圧力限界と流量の制限を超えないようにしてください。 </li><li>水の5カラム容量（CV）でカラムを洗浄します。必要に応じてUV 280トレースが安定するまで、カラム洗浄を続けます。 </li><li>バッファトンの結合に溶出緩衝液とサンプルポンプ内のバッファ、Bの結合でAの入口チューブを浸しO正しいバッファにシステムを平衡化。手動操作によってPumpWashを使用してバッファに入口管を埋めます。 </li><li>ソフトウェアの「メソッドエディタ」モジュールでは、セットアップに使用されることが意図されているカラムのアフィニティークロマトグラフィー法をメソッドウィザードを使用します。 注：自動化されたFPLCシステムは、方法の推奨設定（ すなわち流量と圧力限界）で予め充填し、精製のために選択した列（メーカー、マトリックスおよびサイズ）に基づいてステップを実行しています。 <ol><li>プロテインAアフィニティークロマトグラフィーのための次の実行の手順を実行します。 <ol><li>結合緩衝液の5 CVでシステムを平衡化し、廃棄物容器にフロースルーを収集します。 </li><li>カラムにロードしたサンプルと別々の容器にフロースルーを収集する（ボリュームがメソッドに手動で指定されてロードされます）。 </li><li>結合緩衝液の5 CVで洗浄システムと別の容器にフロースルーを収集します。 </li><li> 5 CVのisocratでカラムを溶出溶出を使用したIC分別はフラクションコレクターによって画分として精製された抗体のサンプルをバッファリングし、収集します。 </li><li>結合緩衝液の5 CVでシステムを平衡化し、廃棄物容器にフロースルーを収集します。 </li></ol></li></ol></li><li>この方法は、設定された後、馴化培地の体積がカラムに適用されるように指定して、メソッドを保存します。 注：メソッドで指定されたボリュームは、サンプルの実行中に空気の導入を回避するために、実際の量よりも5〜10ミリリットル以下でなければなりません。このプロトコルで使用される指定されたボリューム90〜120 mlです。 </li><li>馴化培地を含む容器にサンプルポンプチューブを水没。 </li><li>指定された出口チューブを介して、サンプルフロースルーを収集するために別の容器を準備します。 注：エラーが実行中に発生したり、列の結合能が列または精製rに再適用するフロースルーを必要とする超過した場合に、フロースルーを収集することが重要ですepeated。 </li><li>フラクションコレクターに収集チューブを準備します。 1ミリリットルの画分体積あたりの中和バッファー100μlを加えます。 FPLCシステムが自動的に収集チューブに分画を溶出します。 </li><li>ソフトウェアの「システムコントロール」モジュールでは、この方法を実行するために開きます。 注：メソッドの実行は、メソッドの変数をチェックするフラクションコレクターのセットアップと結果のファイル名と保存場所を定義含む一連のページで開始されます。 </li><li>実行を開始するためにSTARTをクリックしてください。ランは、「システムコントロール」モジュールで監視することができます。 </li><li>精製実行の完了時に、システムソフトウェアの「評価」モジュールで得られたクロマトグラムを確認してください。 </li><li>別のチューブ、緩衝液交換にすべてのタンパク質含有画分を合わせ、カットオフ30kDaの分子量を有する遠心分離フィルター装置を用いて、PBS中で濃縮しました。メーカーのに従って遠心分離ステップを実行します指示。 </li><li>製造業者の指示に従ってビシンコニン酸アッセイ（BCA）を用いて抗体の濃度を測定します。 </li><li>別の精製ランが実行される場合、結合バッファーとリピートの一等地のサンプルポンプチューブは、4.9から4.14を繰り返します。 </li><li>精製の実行が完了した時点で、超純水にA、Bおよびサンプルポンプの入口管を浸漬し、ステップ3で実行されるようなシステムとカラムを洗浄。 </li><li>システム及び列を格納するために20％エタノールで繰り返し洗浄手順でA、B、サンプルポンプチューブを浸します。 </li><li>下流の出口からカラムを外し、カラムストッパーを交換し、その後、入口でカラムを切断し、ストッパーを交換して、システムにチューブを再接続します。 4℃で列を保管してください。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

このプロトコルは、HEK-293細胞にトランスフェクションは、安定な発現および治療用抗体の精製を詳細に説明します。抗体遺伝子の安定な発現は、治療用抗体の開発および製造のための抗体産生細胞株を生成するための最初のステップです。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞は、治療用タンパク質のための最適な発現プラットフォームまま、HEK-293細胞株は、これらの細胞中で産生され?...

治療用抗体の成功は、次世代の治療薬の波が開始されるように、抗体の開発に多額の投資を駆動し続けます。抗体市場は良好な特性4を有する抗体断片1、抗体-薬剤コンジュゲート2、二重特異性抗体3と操作された抗体により再形成されることが期待されます。医薬品の関心を集めて別のクラスは、バイオシミラーです。バイオシミラーの抗体は、すでに規制当局の承認を受けている治療用抗体の製品を複製する「高度に類似」しています。提案されたバイオシミラーは、その構造、機能、動物の毒性、臨床安全性と有効性、人間の薬物動態（PK）、薬力学（PD）および免疫原性5、6に関して創始抗体と同等でなければなりません。 承認rをバイオシミラーの抗体のATEは、製品の最終品質に厳しい制約のために遅れています。このような最終処理工程に至る細胞株及び培養条件の特定等の正確な製造プロセスは、独自のままであり得ます。詳細は何ですか、抗体の製造は、本質的に非常に類似した製品を製造するの挑戦に追加できる変動率を伴います。総合的な物理化学的および生物物理学的特徴との比較は非常に困難である、まだバイオシミラー抗体の特性を実証する多くの研究が文献7、8、9に浮上しています。 治療用抗体の生成は、それぞれの抗体のための遺伝子を保持するベクターを哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションから始まります。ベクター設計、細胞株および培養条件は、元の設定に重要な考慮事項でありますPRESSIONシステム。 抗体のDNA配列は、特許を含む医薬品銀行（www.drugbank.ca）、IMGT（www.igmt.org）や研究出版物から供給することができます。例えば、トラスツズマブのシーケンスは、医薬品銀行（：DB00072 DB ID）を介して利用可能です。可変領域のアミノ酸配列は、所望の宿主種における合成のための遺伝子の設計及び最適化を行うことができます。それは修飾アミノ酸配列に対して行われていないバイオシミラー抗体のために重要です。合成された後、抗体遺伝子を選択した適当なベクターにサブクローニングすることができます。 ヒトIgG抗体は、2つの同一の重鎖と2つの同一の軽鎖からなります。両鎖の密調節された発現は、哺乳動物細胞10における異種IgGタンパク質の最適な生産に不可欠です。鎖間ジスルフィド結合を形成する必要があり、翻訳後修飾の数であることを持っているだけでなく、イントラタンパク質生合成の間にtroduced。ベクトルの数は、抗体遺伝子を（材料の表を参照）を発現するように設計されていますが利用可能です。これらの抗体に特異的ベクターは、通常、それぞれの鎖のように可変領域のみがクローニングを必要とする重鎖及び軽鎖の双方のための定常領域を発現します。 二つの独立した構築物（コトランスフェクション）を用いた細胞のトランスフェクションは、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を送達するための最も一般的なアプローチです。すなわち、各遺伝子は、それ自身のプロモーターにより駆動され、小胞体に組み立てられる前に、別個の抗体鎖として転写されます。一方、多シストロン性ベクターは、mRNA 11の内部領域から許可翻訳有する単一のmRNA転写物として複数の遺伝子の発現を可能に組み込まれた内部リボソーム侵入部位（IRES）要素を有します。この例では、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子はARRANGに接続されています両方の抗体鎖10、12の同時発現を達成するement。 一過性にトランスフェクトされた細胞は、実験の限られた数を実行するのに十分なタンパク質を得ながら、ゲノム組込みのための選択を受けた安定にトランスフェクトされた細胞株は、高い収率を提供できます。より高いタンパク質の量は、in vitroでの特徴付けに関連するアッセイ開発を可能にし、そのようなクローン細胞株とリード候補の選択などの下流の用途を考慮して、抗体の質の指標を提供することができます。 この記事の目的は、哺乳動物発現系において産生さ治療抗体の安定な発現および精製を記載することです。実際、この方法は、バイオシミラーの抗体の発現に適用することができます。この方法は、時間がかかりSTEいえ、重要へ進む前に、抗体の最初の特徴付けのために使用することができますより大規模な製造のための望ましいクローンを同定するPS。また、この方法は、他のタンパク質だけでなく、抗体を発現するために使用することができます。 以下の詳細なプロトコルは、治療用抗体トラスツズマブの発現を記載します。これは、自動化されたクロマトグラフィー法によってHEK-293細胞株と抗体タンパク質の精製における安定なトランスフェクションに続いてベクターDNAの調製から成ります。

<table><tbody><tr><td>pFUSE vector series</td><td>InvivoGen</td><td>N/A</td><td>Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.</td></tr><tr><td>mAbXpress vector series</td><td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td><td></td><td>Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td></tr><tr><td>pVITRO1 vector</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.&amp;nbsp; Refer to: Dodev, T. S. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td></tr><tr><td>GS vector series</td><td>Lonza</td><td></td><td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.</td></tr><tr><td>Multi-cistronic vector series 1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td></tr><tr><td>Multi-cistronic vector series 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td></tr><tr><td>pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&amp;kappa;</td><td>Addgene</td><td>61883</td><td>Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&amp;kappa; was a gift from Andrew Beavil.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro Agar</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-s</td><td>Used to prepare low salt LB agar containing 75 &amp;micro;g/ml hygromycin.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro TB</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-l</td><td>Used to prepare low salt TB broth containing 75 &amp;micro;g/ml hygromycin.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol, BioXtra, &amp;ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td>Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td><td>Astral Scientific</td><td>G221020</td><td>Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).</td></tr><tr><td>FreeStyle 293-F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td>HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.</td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.</td></tr><tr><td>Kolliphor P188</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4894</td><td>Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 &amp;mu;m filter. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine, Linear, MW 25,000&amp;nbsp;</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td>Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 &amp;mu;m filter. Store at -80 &amp;deg;C until use.</td></tr><tr><td>OptiPro SFM</td><td>Life Technologies</td><td>12309-050</td><td>Transfection formulated serum-free media</td></tr><tr><td>Hygromycin B Solution</td><td>Jomar Life Research</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulphoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AJA2225</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone (casein peptone)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 &amp;mu;m filter. Store at 4 &amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml</td><td>Astral Scientific</td><td>09-2051-100</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0403-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTApurifier 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28406266</td><td>Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.</td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid, monohydrate</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOC2123</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOCB0035</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl solution pH 9.0</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOSD8146</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803008/UFC903008</td><td>Used to buffer exchange and concentrate purified protein.</td></tr><tr><td>Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>BLItz System</td><td>fort&amp;eacute;BIO</td><td>45-5000</td><td>Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.</td></tr><tr><td>Protein A biosensors</td><td>fort&amp;eacute;BIO</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution</td><td>Astral Scientific</td><td>786-502</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate (APS)</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0486</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0761</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Astral Scientific</td><td>786-498</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Dual-Color Protein Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr></tbody></table>

laboratory scale production and purification of a therapeutic antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

図1に示すようにトランスフェクトされたHEK-293細胞によるトラスツズマブの安定生産は、バイオレイヤー干渉法（BLI）を用いて確認しました。 IgGの標準曲線は、IgG抗体標準及びタンパク質バイオセンサー（ 図1A）との間の結合速度を測定することによって作製しました。粗上清のサンプルを同様に測定し、その濃度を、標準曲線（ 図1B...

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Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

このプロトコルは、哺乳動物発現系における治療抗体の産生を記載しています。記載されている方法は、ベクターDNAの調製、安定なトランスフェクションおよびアフィニティークロマトグラフィーを用いた大規模な文化や精製の設定ヒト胚性腎臓293細胞株の無血清適応を含みます。

治療用抗体の実験室規模の産生および精製

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

laboratory-scale-production-and-purification-of-a-therapeutic-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.3K ビュー.  University of Sydney. このプロトコルは、哺乳動物発現系における治療抗体の産生を記載しています。記載されている方法は、ベクターDNAの調製、安定なトランスフェクションおよびアフィニティークロマトグラフィーを用いた大規模な文化や精製の設定ヒト胚性腎臓293細胞株の無血清適応を含みます。 

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

タンパク質治療薬の製造細胞株の開発のためのハイスループット自動化されたプラットフォーム

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

医学

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

検出するための実験プロトコール<em&gt;シアノバクテリア</em&gt;抗体マイクロアレイチップと液体と固体試料中の

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

環境学

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few decades, the field of antibody-drug conjugates, bispecific antibodies, chimeric antigen receptors (CAR) and cancer immunotherapy has emerged as the most promising area of basic and therapeutic investigations. With numerous successful human trials targeting immune checkpoint receptors and CAR-T cells in leukemia and melanoma at a breakthrough pace, it is highly exciting times for oncologic therapeutics derived from variations of antibody engineering. Regrettably, a significantly large numbers of antibody and CAR based therapeutics have also proven disappointing in human trials of solid cancers because of the limited availability of immune effector cells in the tumor bed. Importantly, nonspecific distribution of therapeutic antibodies in tissues other than tumors also contribute to the lack of clinical efficacy, associated toxicity and clinical failure. As faithful translation of preclinical studies into human clinical trails are highly relied on mice tumor xenograft efficacy and safety studies, here we highlight a method to test the tumor and general tissue distribution of therapeutic antibodies. This is achieved by labeling the protein-A purified antibody with near Infrared fluorescent dye followed by live imaging of tumor bearing mice.

Here we present a protocol to study the in vivo localization of antibodies in mice tumor xenograft models.

標的抗原特異的治療抗体の腫瘍と組織分布の分析

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

がん研究

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

高スループットの自動モデル IgG1 CHO 細胞での生産のための Microbioreactor システム

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

生物工学

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

自動化された微生物叢システムを用いた中国ハムスター卵巣細胞からのモノクローナル抗体の精製と分析

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Polyclonal antibodies are defined as a collection of antibodies directed against different antigenic determinants of an antigen or several antigens (1). While polyclonal antibodies are powerful tools for identifying biological molecules, there is one important limitation - they are unable to distinguish between antigens that share antigenic determinants. For example, when bovine serum albumin is used to immunize an animal, B cells with different surface Ig will respond to different antigenic determinants on bovine serum albumin. The result is a mixture of antibodies in the antiserum. Because bovine serum albumin shares some epitopes with human serum albumin in evolutionarily conserved regions of the protein, this anti-bovine serum albumin antiserum will also react with human serum albumin. Therefore, this antiserum will not be useful for distinguishing between bovine and human serum albumins.
Several approaches have been taken to overcome the specificity issue of polyclonal antisera. One is by absorbing the unwanted antibodies by passing the antiserum through a chromatography column of immobilized antigens (2). This method is tedious and frequently unable to completely remove the unwanted antibodies. Another approach is to isolate individual antibody-producing B cells and expand them in culture. However, like most normal untransformed cells, B cells do not survive in long-term culture.
To overcome the inability of B cells to survive in culture, one approach is to prepare a myeloma-B cell hybridoma. In 1847, Henry Bence-Jones discovered that patients with multiple myeloma, a lymphoid tumor, produced a large quantity of antibodies (3). B cells in these patients have become malignant and grow uncontrollably. Since the malignant B cells are derived from a single clone, they are identical and produce only a single type of antibody (i.e., a monoclonal antibody, or mAb). However, most of these myeloma cells produce antibodies of unknown specificities. In 1975, by fusing a myeloma cell to a B cell, Cesar Milstein and Georges Kohler succeeded in producing a hybridoma that can be cultured indefinitely in vitro and produces an unlimited number of monoclonal antibodies of known antigenic specificity (4). The rationale behind their approach is to combine the immortal properties of the myeloma cell and the antibody producing properties of the B cell. Their technique revolutionized antibody production and provides a powerful means for identification and purification of biological molecules using monoclonal antibodies.
Generally, preparing a monoclonal antibody requires several months. The general procedure includes the following steps:
<ol>
	<li>Immunization and screening of antibody titer</li>
	<li>Fusion of antibody-producing B cells and myeloma cells</li>
	<li>Selective growth of the hybridoma</li>
	<li>Screening the hybridomas for producing the desired monoclonal antibody</li>
	<li>Cloning by limiting dilution - a process whereby cells are diluted to a concentration to statistically allow for less than 1 cell to be added to the wells of a 96-well plate. Some wells will end up with 0 cells and some will have 1 cell. The wells with seeded with 1 cell will eventually grow into a monoclonal population of cells.</li>
	<li>Growth of the hybridoma and preparation of monoclonal antibody</li>
</ol>
This protocol focuses on the last step - growth of the hybridoma and preparation of the monoclonal antibody. The antibody is purified from the culture supernatant by ammonium sulfate precipitation (often referred to as salting out) - a commonly used method of removing proteins from a solution. Proteins in solution form hydrogen bonds, along with other hydrophilic interactions, with water through their exposed polar and ionic groups. When concentrations of small, highly charged ions (such as ammonium or sulfate) are added, these groups compete with the proteins for binding to water. This removes the water molecules from the protein and decreases its solubility, resulting in precipitation of the protein.

Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

抗体生成:ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の産生

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

Education

JoVE Science Education

高等生物学

免疫学

Production and Purification of Recombinant Antibodies from Mammalian Cells

Source: Shivange, Gururaj, et al. <a href="https://app.jove.com/v/60727">Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen-Specific Therapeutic Antibody.</a> J. Vis. Exp.(2020).
The video explains the process of producing antibodies in mammalian host cells, from gene expression to secretion. It involves transcription, translation, signal recognition, correct folding, and eventual release into the extracellular medium via secretory vesicles.

哺乳類細胞からの組換え抗体の作製と精製

1. Expression and purification of antibodies

	Maintenance of CHO cells
	
		Grow CHO cells in FreeStyle CHO Media supplemented with commercially available ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

抗体ベースの技術

製造と精製

A Technique to Purify Monoclonal Antibodies Produced by Chinese Hamster Ovary Cells

Source: Velugula-Yellela, S. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58947">Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay for purifying monoclonal antibodies from cell culture fluid harvested from Chinese Hamster Ovarian cells. It employs a porous glass resin with immobilized protein A, which binds to the Fc region of the antibodies in the sample, effectively separating them from contaminants. The use of a low-pH elution buffer weakens the interaction, facilitating the retrieval of purified antibodies.

チャイニーズハムスター卵巣細胞が産生するモノクローナル抗体を精製する技術

1. Purification of antibody
NOTE: The equilibration buffer for the in-house antibody is 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5. The elution buffer used is 0.1 M ...

Antibody Production from a Batch Overgrowth Culture of Transfected Mammalian Cells

Source: Elgundi, Z. et al., <a href="https://app.jove.com/v/55153">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017)
The video demonstrates a method for producing therapeutic antibodies using stably transfected mammalian cells. Tryptone supplementation stimulates cell division, resulting in overgrowth and supporting a higher antibody yield. The antibody-containing medium is harvested, filtered, and stored for further use.

トランスフェクションされた哺乳類細胞のバッチ過剰増殖培養による抗体産生

NOTE: A suitable mammalian expression vector must be used for this protocol. Here, a single construct containing two expression cassettes is used ...

An Affinity Chromatography Technique for the Purification of Monoclonal Antibodies

Source: Elgundi, Z., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55153">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique for purifying monoclonal antibodies from the culture supernatant obtained from an antibody-producing cell culture. The process involves using a matrix of crosslinked agarose beads with conjugated Protein A, which immobilizes the antibodies in the supernatant on the beads, allowing for effective separation from contaminants. By applying an elution buffer with low pH, the protein A-antibody interaction is loosened, facilitating the collection of antibody-containing fractions.

モノクローナル抗体の精製のためのアフィニティークロマトグラフィー技術

1. Antibody Purification by Affinity Chromatography Using an Automated Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System
NOTE: The following procedure can ...