総局は、テキサス大学南西医療センターの恵まれている学者プログラムからの資金によって支えられました。著者は VSV した DsRed の VSV リュック提供ありがとうマイケル Whitt (テネシー大学保健科学センター) とショーン ・ ウィーラン (ハーバード大学医学部)。著者はまた、VACV FL GFP ひずみの種類のギフトのゲイリー Luker (ミシガン大学医学部) を感謝します。

1. 全般的な強区(LD652) 細胞とウイルス培養
<ol><li>
LD652 細胞培養とめっき
	<ol>
<li>L. 区の文化-派生 LD652 細胞維持培 (材料表) 通常の雰囲気下で 27 ° C で培養した細胞の単層。10 cm の組織文化扱う料理の細胞を維持し、80% の confluency に達したら細胞を通過します。</li>
		<li>プレート、メディア化単分子膜 (これらの細胞には trypsinization を遊離させるのには不要) を繰り返しをピペッティングによるプレートから付着 LD652 細胞を取り除くと 1 x 10 の5セル/mL のおおよそ密度の成長媒体のサンプルを希釈します。24 ウェル プレートの希釈文化/井戸の 1 mL のピペットします。各時間ポイント (最大 8 治療/プレート) 3 つのレプリケートの井戸/トリートメント タイプの最小を種します。</li>
		<li>1 時間の最小値のために解決するために細胞を許可します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ワクシニア ウイルス作製
	<ol>
<li>VACV の在庫の準備、hela 細胞でウイルスを増幅する細胞20またはアフリカミドリザル腎細胞 (BSC 1 または BSC 40 セル)20,21,22。 注: VACV ひずみウェスタン リザーブ (VACV WR) は、ここで説明した試金でよくはたらきます。</li>
		<li>BSC 1 または BSC 40 セル20,22プラークアッセイを介してVACV ひずみを滴定しなさい。 注: すべては VACV 多様性感染症 (MOI) のここに記載した LD652 細胞感染、BSC 40 プラクの試金から得られる価に基づいて示されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
水疱性口内炎ウイルスの準備
	<ol>
<li>VSV 株式を準備、BHK 細胞23でウイルスを増幅します。</li>
		<li>BSC 40 または BHK 細胞膜13,23にプラクの試金で VSV 滴定しなさい。 注: すべての VSV モアは BSC 40 プラクの試金から得られる抗体に基づく細胞感染症 LD652 のここで説明。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 蛍光ベース VSV マーカーレスキューアッセイ共同感染と住セルイメージ投射を使用して
<ol><li>
シードと LD652 細胞の伝染
	<ol>
<li>8 よくチャンバーの 40,000 の LD652 細胞/ウェルをプレートします。</li>
		<li>蛍光ベースの生細胞イメージング、VSV 系統蛍光タンパク質をエンコードを使用します。ここで示した実験は VSV した DsRed17、他の VSV の蛋白質に融合しない無料の下流蛋白質を表現する遺伝子組換え VSV ひずみを使用します。 注: LD652 細胞の VSV 伝染がない 96 hpi によって変性あり、したがって、細胞死が交絡因子この時間枠内で VSV レプリケーションを評価するとき。</li>
		<li>無血清メディア (SFM で VSV した DsRed と VACV-フロリダ州-GFP を準備します。材料の表)1 の 25、MOI でそれぞれ。 注: VACV-フロリダ州-GFP は、リュックと GFP の24の融合を表現する組換え VACV 株です。25 以上の慣性モーメントを用いた VACV 系統により感染した13を LD652 のすべてのセルにされます。別の coinfecting ウイルスを使用している場合、MOI はユーザーによって経験的に定められる必要があります。各感染症の治療重複する井戸でセットアップする必要がありますは、モック感染治療のみ SFM がセルに追加されます。</li>
		<li>0.2 ml 接種 27 ° C で 2 時間の細胞をインキュベートします。</li>
		<li>0.5 ml/成長媒体のセルを洗浄します。</li>
		<li>27 ° c. の 45 分の成長媒体の細胞生存性色素 (材料表) の 25 μ M で細胞をインキュベートします。</li>
		<li>メディアを吸引し、洗浄 1 x 0.5 ml/余分な染料を取り除くために。</li>
		<li>0.3 mL/成長媒体の細胞を維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
セル画像のキャプチャをライブします。
	<ol>
<li>8 よくチャンバーディッシュを読み込むし、共焦点顕微鏡 30 分事前に入れます。 注: 部屋の温度 20-25 ° C から視覚化される LD652 細胞が、最適な条件の部屋の温度は 27 ° c. に調整必要があります。</li>
		<li>位相コントラストの画像設定と同様に、イメージを作成する各蛍光マーカー蛋白質の適切な励起/蛍光設定を設定します。</li>
		<li>各チャンネルのレーザーの強さを調整します。 注: これは最後の実験で使用される時間のコースにおいて蛍光シグナル強度の範囲を決定するためのパイロット実験を実行している必要があります。</li>
		<li>必要な時点までの伝染の持続期間のため各すべての 1-5 h の位相コントラストと蛍光画像をキャプチャ対物レンズ 10 倍を使用して (e.g。、48-72 hpi)。 注: 各井戸文化全体の感染率を推定するビューの複数のフィールドをキャプチャすることが重要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
画像解析
	<ol>
<li>適切な蛍光チャネルの自動画像解析用の画像解析ソフトウェア (e.g。 405、488 nm nm、568 nm)。</li>
		<li>感染している細胞の割合を計算する除算 VSV 感染を示す蛍光セルの合計数 (e.g、VSV した DsRed 感染した DsRed 陽性細胞) の細胞性色素でラベル付けされた実行可能なセルの合計数で。それぞれのフィールドはビューからすべての治療法の間で</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 一般的なウイルス感染プロトコル LD652 細胞における発光ベース VSV 救助の試金のため
<ol><li>
接種の準備
	<ol>
<li>感染する前に 30 分は VSV リュック16 (組換え VSV ひずみ無料ホタル ルシフェラーゼ蛋白質はない任意他の VSV 蛋白質に溶けるその表現) の株式を解凍します。VACV 重感染中 VSV リュック救助のための試金場合も氷の上 VACV WR ウイルスを解凍します。 注: (WR) VACV 以外にも他のウイルス、重感染中に VSV リュックを救う可能性がありますが、これは各ユーザーによって、経験的に決定する必要があります。</li>
		<li>10 と 25 の MOI は、それぞれ、0.2 mL の合計接種ボリュームを追加するとき達成されるように SFM に VACV WR の存在有無で VSV リュックを希釈して接種の準備/まあ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞の伝染
	<ol>
<li>単層の妨害を避けるために慎重に成熟した LD652 メディアを吸引し、ウイルス/ウェルの 0.2 mL を接種します。今回は、0 hpi として定義されます。ネガティブ コントロール治療の「モック感染」として機能する追加の井戸に滅菌 SFM を追加します。</li>
		<li>27 ° C で 2 時間菌の細胞をインキュベートします。</li>
		<li>2 hpi 吸引により接種を削除/1 mL に置き換えると LD652 成長媒体をよきます。</li>
		<li>感染 24-72 hpi を続行するを許可します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ルシフェラーゼ アッセイ
<ol><li>
セル lysates の準備
	<ol>
<li>慎重に、上清を吸引ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 1 mL を加えて、/まあ。</li>
		<li>DPBS に細胞をこすり 1 mL シリンジのプランジャーを使用する。</li>
		<li>遠心チューブ 400 x gで 4 ° C で 20 分間遠心し、細胞を転送します。</li>
		<li>一方、記者の換散バッファー (RLB) 滅菌 H2o ・ x 5 の 1 x 希釈を準備します。</li>
		<li>以下の遠心分離、細胞ペレットを乱すことがなく、DPBS を吸引します。</li>
		<li>1 の 150 μ L でペレットを再懸濁します x RLB。</li>
		<li>凍結融解性常温水お風呂の急速な雪解けに続いて-80 ° C のフリーザーで 5 分孵化を使用して x サンプル 1分析する準備が整うまで-80 ° c lysates を格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ルシフェラーゼ アッセイ
	<ol>
<li>雪解けの氷の溶解液。</li>
		<li>ソリッドの黒または白 96 ウェル マイクロ プレートのウェルに lysate の 20 μ L をピペットします。</li>
		<li>各ウェルに 100 μ L のルシフェラーゼ アッセイ試薬を追加します。</li>
		<li>すぐに、ルミノを使用して照度を測定 (特定の luminometers の適切な設定はユーザーによって、経験的に決定する必要が)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ルシフェラーゼ アッセイ分析
	<ol>
<li>コントロール トリートメント (代表結果) から得られる LU 読みに各治療のため LU 信号を正規化します。少なくとも 3 つの独立した実験が行われた後、適切な統計テストによって LU はそれぞれ治療/対照群から得られた平均を分析できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. イムノブロット
<ol><li>SDS ページの適切な試薬およびインストルメンテーションを使用して、後続のイムノブロット リュックの試金の抽出の lysates を使用します。</li>
</ol>6. LD652 細胞培養から VSV の価
<ol><li>手順 1.1 によると LD652 細胞をプレートします。</li>
	<li>ステップ 3 に従って細胞をウイルスに感染します。</li>
	<li>必要な時点で無菌マイクロ遠心チューブ用に培養上清を収集します。</li>
	<li>4 ° C で 10 分間 1,000 x gを使用してセルをペレットし、培養上清を新しいチューブに転送します。</li>
	<li>-80 ° C で培養上清を保存または BSC 40 セルのプラクの試金によって滴定を行います。 注: VACV に含まれている LD652 細胞培養から VSV を滴定は、残留 VACV 粒子が BSC 40 単分子膜13にプラークを形成するを防ぐために、2 の hpi 内 BSC 40 文化メディアに 100 μ g/mL 36. (AraC) を追加することをお勧めします。AraC がウイルスの DNA ポリメラーゼ阻害剤 VACV DNA 複製25をブロックが VSV のレプリケーションには影響しません。</li>
</ol>7. 発光ベース VSV のバリエーションを救う LD652 細胞の試金: RNAi とプラスミドのトランスフェクション実験
<ol><li>
ウイルスの RNAi によるノックダウンの dsRNA の準備または成績証明書をホスト
	<ol>
<li>T7 プロモーターのいずれかを対象とする (TAATACGACTCACTATAGGG) の 5' 端に設計遺伝子特定のプライマーの尾 coinfecting ウイルス (例えばVACV) または興味のL. 区mrna。これらのプライマーは、効果的な RNAi によるノックダウンの 400-600 bp の PCR の製品を生成する必要があります。ギャモンらを参照してください。13のプライマー シーケンスは LD652 セル dsRNA を介した RNAi による成績証明書下ノックダウンの VACV またはL. 区に使用されます。 注: L. 区mRNA から成績証明書を識別することができますは、 L. 区トランスクリプトーム データベース26,27,28を公開しました。</li>
		<li>で生成、DNA テンプレート経由でRT-PCR (cDNA 合成: 50 ° C の 1 サイクル 30 分;PCR: 94 ° C の 40 のサイクルの 15 s、30 ° C、50 s、および 45 68 ° C それぞれ秒)。</li>
		<li>PCR 精製キットを使用して PCR の製品を浄化します。</li>
		<li>精製 PCR の製品を使用すると、テンプレートとして、体外を書き写すし、浄化 dsRNAの in vitro転写と精製キットを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DsRNA またはプラスミッド DNA LD652 細胞へのトランスフェクション
	<ol>
<li>種子 1 x 10 の5セル/24 ウェル プレートのウェルとセルを少なくとも 1 時間のために解決しましょう。</li>
		<li>導入するのにも、SFM の 100 μ L にトランスフェクション試薬の 4 μ L を薄くしなさい。最大 15 分室温で孵化させなさい。これは、実行するすべての transfections のマスター ミックスを作るためスケーリングできます。</li>
		<li>導入するためにも、各 SFM の 100 μ dsRNA または合計プラスミド DNA の 1 μ g まで希釈します。最大 15 分室温で孵化させなさい。 注: 私達は 1 μ g の dsRNA/105 LD652 細胞のトランスフェクションに十分であることを発見した以前 > 80% ノックダウンいずれかのウイルスまたはホスト成績13dsRNA の用量が必要変更実験セット持ち上げる/条件する必要が経験的決定されます。</li>
		<li>1:1 の比率でトランスフェクション試薬と dsRNA/プラスミッド DNA の希釈を組み合わせる (例えば、希薄 dsRNA の 100 μ L は希薄トランスフェクション試薬の 100 μ L を混合) 室温で 20 分間インキュベートし、。</li>
		<li>一方、1 ml/SFM の井戸を洗浄し、各ウェルに SFM の 500 μ L を追加します。</li>
		<li>ゆっくりとトランスフェクション試薬 dsRNA (またはプラスミッド DNA) を追加混合物を各ウェルに滴下します。</li>
		<li>5 h の細胞でのトランスフェクション試薬を孵化させなさい。<ol>
<li>RNAi の実験成績証明書 (例えばVACV)、coinfecting ウイルスによってエンコードのノックダウンに置き換えますトランスフェクション試薬 5 h トランスフェクション潜伏期間後 VSV リュックを含むウイルスの接種材料 (VACV の有無や別の coinfecting ウイルス) (ステップ 3)。その後、完全な成長メディア 2 hpi VSV リュックを含むウイルスの接種材料を取り付けます。リュックの試金 (ステップ 4) は、ウイルスゲノム転写産物を coinfecting のノックダウンは VSV リュック救助の損失につながるかどうかは、さまざまな時点での抽出の lysates を実行できます。</li>
			<li>RNAi 実験L. 区成績の RNAi、トランスフェクション ミックスを完全な成長媒体に置き換えるし、VSV リュック (手順 4) に感染する前に 24 時間の結果として起きるにノックダウン。リュックの試金 (ステップ 4) は、 L. 区成績のノックダウンが VSV リュック救助を促進するかどうかを決定するためのさまざまな時点での抽出の lysates を実行できます。</li>
			<li>実験候補免疫調節薬を表現するプラスミド発現ベクターの transfections、トランスフェクション試薬を置き換えるし、VSV リュック (ステップ 4) で感染前に 24 h の蛋白質の表現を可能にします。リュックの試金 (ステップ 4) は、候補免疫調節タンパクの発現は VSV リュック救助を促進するか判断するための様々 な時点で抽出された lysates を実行できます。 注: ここでトランスフェクションの効率は 40-6013で 1 μ g/よくプラスミド DNA 結果の説明トランスフェクション条件。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+of+the+Lymantria+dispar+(gypsy+moth)+larval+midgut+in+response+to+infection+by+Bacillus+thuringiensis.">Transcriptome of the Lymantria dispar (gypsy moth) larval midgut in response to infection by Bacillus thuringiensis.</a> PloS One. 8 (5), e61190 (2013).</li><li>Sparks, M. E., Gundersen-Rindal, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymantria+dispar+IPLB-Ld652Y+cell+line+transcriptome+comprises+diverse+virus-associated+transcripts.">The Lymantria dispar IPLB-Ld652Y cell line transcriptome comprises diverse virus-associated transcripts.</a> Viruses. 3 (11), 2339-2350 (2011).</li><li>Lin, G., Li, G., Granados, R. R., Blissard, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+cell+lines+expressing+baculovirus+P35:+resistance+to+apoptosis+and+nutrient+stress,+and+increased+glycoprotein+secretion.">Stable cell lines expressing baculovirus P35: resistance to apoptosis and nutrient stress, and increased glycoprotein secretion.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 37 (5), 293-302 (2001).</li><li>Li, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing.">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li><li>Kanost, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+biological+insights+from+a+draft+genome+sequence+of+the+tobacco+hornworm+moth,+Manduca+sexta.">Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).</li><li>Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+chikungunya+and+dengue:+the+causes+and+threats+of+new+and+re-emerging+arboviral+diseases.">Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases.</a> BMJ Global Health. 3, (2018).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで制限の鱗翅目昆虫の細胞培養で VSV レプリケーションを救出条件画面に蛍光・発光ベースのシンプルなアッセイを説明しました。鱗翅目昆虫細胞で VSV の不成功の伝染は、VSV 遺伝子発現のための試金と優れた信号対雑音比を作成します。たとえば、単一の VSV リュック感染から溶解液で検出される LU 信号があった 〜 1,000 倍以上のモック感染 lysates まだこれらの信号のみ 72 h 経過で約 2 ...

生産的、特定のホストに複製するウイルスの機能は、一部ウイルス エントリおよびレプリケーション1をサポートする宿主細胞因子の可用性によって決まります。ウイルス-宿主範囲は、カウンター細胞の抗ウイルス防御ウイルス複製2,3妨げになるそれ以外の場合にウイルスの容量によっても決定することができます。それは最終的にウイルスが特定のホストにそのライフ サイクルを完了できるかどうかを決めるこれらの複雑なウイルス-宿主相互作用の結果です。ウイルス複製のすさまじいホストの可能性がある病原性の結果を与えられて、それは失敗に終わったと生産性のバランスをひっくり返すかもしれないキー ウイルス-宿主間の相互作用の理解を深める実験的戦略を開発する重要です感染症。ウイルス-宿主相互作用の分子の機能を解明新しいと代替の抗ウイルス治療戦略の開発に尽力されます。
RNA 干渉 (RNAi)4,の出現で5とゲノム編集ツール (e.g、CRISPR Cas9、亜鉛指 TALENs 核酸分解酵素)6、7、が可能になりつつ実験を変更する、。ゲノムの細胞因子の発現は拡張し、ウイルスの複製におけるこれらの変化の影響を探索します。確かに、多数の RNAi とゲノム編集による画面のウイルス-宿主間相互作用8,9,10、の新たな側面を明らかにした無脊椎動物と脊椎動物のホスト細胞の種類で行われています。11,12. これらの画面は、通常ウイルス記者、ホタルのルシフェラーゼ (リュック) や蛍光タンパクなどをエンコードを採用 (e.g、GFP、下流)、読み出しとしてウイルス遺伝子発現を定量的に評価するの便利な手段を提供する。ウイルスの複製9,12。この方法により、いずれかを促進するまたはそれぞれ増加または減少、によって証明されるウイルスの複製の反感を買う、ウイルス記者信号9,12ホスト因子を特定する研究者です。ただし、ほとんどの場合で、これらの画面はよく検討されているホスト セルの種類に適応しているウイルスを使用して行われています。この戦略は、ウイルスの病原体の自然宿主と共進化の関係を理解するために重要なことができますが、それは暴く宿主の抗ウイルス因子の使用に関する基本的な懸念を提起します。これらのケースでウイルス記者の向上は RNAi ノックダウンが捜されているまたは通常ウイルスの複製を妨げる細胞因子の不活化に信号を送る。まず、ウイルスがロバスト制御条件下で検討されている宿主細胞で複製することが既にいる場合画面 (すなわち背景と強化されたウイルス記者信号を区別する能力) のダイナミック レンジが制限あります。第二に、この問題はウイルスが宿主細胞によく適応し、画面でターゲットにされているホストの防衛の経路に対抗するに有効である状況によってさらに悪化します。
伝統的なウイルス-宿主相互作用スクリーニング法に関する上記の懸念のため、鱗翅目の昆虫細胞で当然のことながら失敗に終わったアルボ ウイルス感染を悪用するウイルス-宿主間の相互作用を研究するための新たなパラダイムを開発しました。この戦略は、よく研究人間アルボ、VSV がマイマイガ (L. マイマイガ)13由来細胞で失敗に終わった感染を受ける観察から派生します。VSV は自然哺乳類を宿主に双翅目昆虫 (すなわちチョウバエ) によって送信し、の脊椎動物のホスト細胞文化とin vivo14無脊椎動物の広い範囲に感染するのに実験的に示されています。VSV の 11 kb 負意味一本鎖 RNA ゲノムそれぞれはエンベロープ ウイルス粒子を構成するタンパク質に翻訳される 5 つのサブゲノム Mrna をエンコードします。ただし、VSV 逆遺伝系リュックまたは 5 自然 VSV 遺伝子製品15,16,17に加えて、蛍光タンパク質をエンコード レプリケーション主務系統の作成許可されています。これらのレポーター蛋白質は VSV virion に組み込まれません、VSV 遺伝子発現後のエントリに発生する便利な読み出しを実現できます。VSV 系統 GFP などリュックのエンコーディングを使用して、我々 は以前に VSV 遺伝子発現は LD652 セルのエントリ時に厳しく制限されることと、VSV 抗体は感染後 72 時間 (hpi) で増やさない。対照的に、VSV と哺乳類のポックス ウイルス、ワクシニア ウイルス (VACV)、LD652 細胞の重感染は、この時点で VSV 遺伝子発現と抗体の対数の向上につながります。VACV を受ける初期遺伝子発現、DNA 複製と LD652 細胞感染後期遺伝子発現 VACV レプリケーション サイクルが不完全なウイルス粒子の形態形成18のため最終的に失敗に終わった。~ 192 kb DNA ゲノム VACV の多くはホストの免疫反応の19の抑制することによってウイルスの複製を促進する免疫調節プロパティを表示 > 200 タンパク質をエンコードします。したがって、我々 は VACV 重感染による LD652 細胞の複製 VSV「レスキュー」だった通常 VSV の複製を制限するL. 区応答を抑制する免疫調整物質 VACV を介した可能性が高いことを仮定しました。この、サポート ホスト RNA ポリメラーゼ II 阻害剤アクチノマイシン D LD652 細胞の治療はまた VSV レプリケーション LD652 細胞における転写非依存性ホスト応答ブロック VSV レプリケーション後エントリ13のことを示すを救助します。
上記の示唆、LD652 細胞の VSV 感染への当然のことながら制限的な性質があります比較的低バック グラウンド レポーターの VSV でエンコードされた信号 (すなわちホストを阻害するものを強化する条件のスクリーニング抗ウイルス防御)。ここでは、鱗翅目昆虫細胞で VSV 制限を緩和条件の蛍光または画面にリュックに基づく試金を使用するための方法を提供します。まず、これらの試金を使用して破る VSV 制限いずれかの重感染実験中または候補ウイルス因子の異所性発現によってエンコードされたウイルスの免疫調節因子を特定する方法を示します。例として、我々 は我々 は救助その他のポックス ウイルスの要因13の不在で VSV レプリケーション免疫調節因子の新しい家族の一員として A51R のポックス ウイルス符号化された蛋白質を識別するためにこれらのスクリーニング技術を使用する方法を示します。第二に、RNAi 制限 VSV LD652 細胞感染のスクリーニングを使用して直接アルボ制限13真核生物の宿主因子を特定する方法を示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>C430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX-CELL 420</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14420C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Optima</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:1 mixture of Grace&#39;s Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Free Media (SFM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10902096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10362100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter lysis buffer 5X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E3971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-FLAG antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>014-22383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-firefly luciferase antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-VSV M</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dr. John Connor (Boston University)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-VACV I3L</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dr. David Evans (University of Alberta)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well Chambered dish</td>
			<td>Lab-Tek II</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell viability dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C12881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV10i-LIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>v1.18</td>
			<td>cellSens software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5702 ventilated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc Infrared Imaging System</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Odyssey Fc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD652 cells</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSC-40 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSC-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitro transcription and purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

arbovirus infections as screening tools for the identification of viral immunomodulators and host antiviral factors

RNA 干渉とゲノム編集ベースのスクリーニングのプラットフォームは、ウイルスの複製を制限する宿主細胞因子を識別するために広く使用されています。ただし、これらの画面は自然寛容な検討中のウイルスの病原体が細胞で普通行なわれます。したがって、制御条件下でウイルスの堅牢なレプリケーションはこれらの画面のダイナミック レンジを制限があります。さらに、これらの画面はウイルスがホストによく適応し、抗ウイルス防御に対抗できる場合にウイルスの複製を制限する細胞防御経路を簡単に識別することができないがあります。この記事では当然中止になる感染症の水疱性口内炎ウイルス (VSV) などアルボ ウイルスによるセンター スクリーンを使用してウイルス-宿主間相互作用を探索するための新しいパラダイムをについて説明します。双翅目昆虫と哺乳類のホストの広い範囲で複製 VSV の能力、にもかかわらず VSV はマイマイガ (強マイマイガ) などの鱗翅目昆虫由来細胞株の様々 なポスト エントリ、感染を受けます。しかし、これらの失敗に終わった VSV の感染症救えることができる""ホスト細胞の抗ウイルス防御が危害を受けたとき。便利なレポーター遺伝子と制限・ l ・区の VSV の株について述べるセルラインはアルボ ウイルスの制限に関与する宿主因子を識別するためにセットアップ画面に組み合わせることができます。さらに、VSV レプリケーション重感染中または哺乳類のウイルスによってエンコードされているを含む異所性の表現を救出するバイラル エンコードされた因子の同定にこれらのスクリーニング ツールの有用性をまた示します。L. 区細胞の複製 VSV 自然の制限を監視する単純な発光と蛍光ベースの試金の使用ができ、VSV 救助を促進する条件のスクリーニング時高い信号対雑音比を提供しますVSV レプリケーションに変更。これらの方法は、応答したホストとウイルスの免疫回避要因間の相互作用を理解するため貴重です。

VACV 重感染時に VSV 救助を監視する生細胞イメージング アプリケーションの例として LD652 セルが 8 ウェル チェンバード皿にメッキ モック感染や VSV 下流に感染 (MOI = 1) VACV-フロリダ州-GFP の有無で (MOI = 25)。VSV した DsRed 無料蛋白質としてした DsRed を表現、VSV 構造蛋白質 (図 1 a) に融合しないため、VSV エントリと遺伝子発現を開始した後のみ検出...

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Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

アルボ ウイルス複製とアルボ ウイルス複製を制限する 2) 真核生物の宿主因子を促進する免疫調整物質 1) ウイルス エンコードを識別するためにプロトコルを紹介します。これら蛍光や発光を用いる方法は、急速に量的な読み出し信号対雑音比の低い単純なアッセイのアルボ ウイルス複製を取得する研究者を許可します。

アルボ ウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニング ツールとして

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

arbovirus-infections-as-screening-tools-for-identification-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.8K ビュー.  University of Texas Southwestern Medical Center. アルボ ウイルス複製とアルボ ウイルス複製を制限する 2) 真核生物の宿主因子を促進する免疫調整物質 1) ウイルス エンコードを識別するためにプロトコルを紹介します。これら蛍光や発光を用いる方法は、急速に量的な読み出し信号対雑音比の低い単純なアッセイのアルボ ウイルス複製を取得する研究者を許可します。

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワク</em使用して>ウイルス感染ショウジョウバエセル

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

免疫・感染学

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

呼吸器病原体に対する宿主細胞応答を研究するために偏ヒト気道上皮Calu-3細胞の液体に覆われた文化の確立<em&gt;インビトロ</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

宿主細胞のRNA合成でウイルス感染の効果を測定するためにクリックケミストリーを用いた

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

非宿主抵抗性に関与する遺伝子の同定のためのVIGS媒介フォワード遺伝スクリーニング


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

抗ウイルス化合物の同定および評価のための早期のウイルス侵入アッセイ

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

の検出のための凍結乾燥LAMP法試薬の開発<em&gt; Q熱リケッチア</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

母体・胎児のインターフェイスでの感染症を研究するためにヒト胎盤および脱落膜器官培養

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡ベースのアッセイ<em&gt;ブルセラ</em&gt; HeLa細胞の感染

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

アルボ ウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニング ツールとして

アルボウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニングツールとして