ミトコンドリアは神経の健康に不可欠です。多くの神経変性疾患では、軸索ミトコンドリアが最初に罹患しますが、軸索ミトコンドリアがそれほど特別な理由は明らかではありません。このプロトコルで使用されるチャンバー内の流体圧力勾配は、ミトコンドリア軸索の選択的治療を可能にする。
これにより、細胞体のプロセスが乱されることなく、軸索生物学に集中することができます。ここでは、膜電位感受性色素によるミトコンドリアの脱分極を示しますが、この方法は多くの異なる神経細胞タイプと蛍光読み出しに適用できます。まず、コード化された6つのウェルプレートを滅菌フードに入れ、滅菌二重蒸留水で2回洗浄します。
プレートを傾斜した状態で3〜5分間乾燥させます。真空吸引またはピペッティングによって余分な水分を取り除きます。次に、マイクロ流体チャンバーを80%エタノールに浸します。
再度、マイクロ流体チャンバーを傾斜した状態で3〜5分間乾燥させ、ピペットチップで余分なエタノールを除去します。完全に乾いたら、マイクロ流体チャンバーをウェルとプレートの中央に置きます。マイクロ流体チャンバーの境界と中央のマイクロ溝セクションを軽くたたいて、ガラス板に適切に取り付けます。
まず、1.5ミリリットルの反応管に所望の数の解離した海馬ニューロンを集める。チューブを1000倍Gで室温で4分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを8マイクロリットルのB−27神経基礎培地に再懸濁する。
次に、細胞溶液をマイクロ流体チャンバーのチャネル入口に分注します。プレートの裏側をタップして、チャネルを通る流れを支援します。ピペットを使用して、チャネルの出口で残っている細胞懸濁液を吸引します。
マイクロ流体チャンバーを細胞とともに摂氏37度、二酸化炭素5%で15〜20分間インキュベートします。次に、上部の軸索ウェルに50マイクロリットルのB-27神経基底媒体を満たし、プレートの背面をタップして流れを補助します。体細胞側の各ウェルを150マイクロリットルのB-27神経基底媒体で満たし、上部に張力バブルを作成します。
また、軸索側の両方のウェルをそれぞれ100マイクロリットルのB-27神経基底培地で満たす。7〜8日間のin vitro培養の後、軸索が微小溝を通って成長し、軸索コンパートメントに伸びていることを確認します。B-27神経基底培地を除去し、軸索チャネルと体細胞チャネルの両方の上部ウェルに100マイクロリットルの予熱したイメージング培地を加えて、デバイスを洗浄します。
培地を下のウェルに流します。下のウェルから培地を取り出し、上のウェルから残った培地を取り除き、新しい培地で繰り返し、洗浄の最後にウェルを空のままにします。次に、100マイクロリットルの5ナノモルTMRE希釈液を体細胞ウェルと軸索上部ウェルの両方に追加します。
すべてのウェルに等しい容量になるまで、培地を両方のコンパートメントに流します。TMRE含有培地を充填します。体細胞コンパートメントの関心領域を選択し、それを微小溝を通って軸索コンパートメントにたどります。
体細胞コンパートメントと軸索コンパートメントで画像化された微小溝が互いに一致していることを確認してください。ファイル名を変更後、励起波長561ナノメートル、発光波長625ナノメートルの赤色蛍光画像を取得します。体細胞側に張力気泡が存在することを確認することにより、体細胞室と軸索室の間の体積差を確保します。
次に、チャネル内の培地を除き、軸索側の両方のウェルから画像化媒体を除去する。ミトコンドリアの脱分極を誘発するには、イメージング培地で希釈した160マイクロリットルの20マイクロモル抗マイシンAを上部軸索ウェルに追加します。両方の軸索ウェルに等しい体積になるまでチャネルを流します。
マイクログルーブを特定することにより、ベースライン取得時と同じ位置がイメージングされるように、イメージングを繰り返します。このプロトコルを使用して、初代海馬ニューロンをマイクロ流体デバイスで成長させ、続いて膜感受性色素TMREでミトコンドリア染色を行いました。ミトコンドリアの均質染色は微小溝の両側で観察されたが、中央では観察されなかった。
抗マイシンAを軸索側に添加すると、ソームミトコンドリアはTMREシグナルを保持しましたが、軸索ミトコンドリアから蛍光が失われました。 デバイスを組み立てる前に、ウェルまたはデバイスに水分が残っていないことを確認してください。そうしないと、チャンバーは密閉されません。この方法を用いて、軸索のミトコンドリア機能の喪失と局所機能の影響、および逆行性シグナル伝達と全体的な細胞生存への影響を研究することができます。
ミトコンドリアの生合成は、長い間、細胞体内でのみ起こると考えられていました。この方法により、軸索ミトコンドリアの損傷にはPINK1タンパク質のショートの局所翻訳が必要であることを明らかにしました。
