この方法は、モデルに関連する神経保護天然化合物のスクリーニングに関する神経科学および伝統的な口腔医学研究分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、感染量の高い容積が虚血タイミング用量に従う点である。この方法の視覚的なデモンストレーションは、滅菌顕微鏡を使用して原型の中小脳動脈に非常に薄い実装物を挿入することが典型的であるため、重要である。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室で勉強している学年のセウン・リーです。グリチルリザエ・ラディックス・エ・ライゾーム抽出物(GRex)を調製するには、まず200グラムのグリチルリザエ・ラディックス・エ・リゾーム(GR)を2リットルのメタノールに加え、室温で5日間インキュベーションします。インキュベーションの最後に、5マイクロメートルの細孔サイズの厚さ0.26ミリメートルのフィルターペーパーを通して溶液をひずみます。
GR残渣を1リットルのフレッシュメタノールに加え、再度溶液を濾過します。2つの濾液を組み合わせ、新しいフィルターペーパーでそれらを歪めます。その後、凍結乾燥する前に真空下で抽出物を濃縮し、GRexを生成します。
GRexを投与用に調製するには、凍結乾燥物をジメチルスルホキシドに溶解し、0.9%生理食塩水で混合物を希釈する。その後、0.45マイクロメートルのシリンジフィルターを介して溶液をフィルタリングし、 DMSOの最終濃度を5%未満に調整して、マウス中脳動脈閉塞モデル(MCAO)を設定するには、麻酔付き6週間齢の22〜25グラムの雄C57BL/6マウスで尾刺激に対する応答性の欠如を確認し、マウスを36.5度の摂氏体温保持毛布に置き、温度計に接続する。剃毛と脱毛クリームでマウスの胸と首からすべての毛髪を取り除いた後、マウスを実体顕微鏡下に置き、首の中央に2センチメートルの皮膚切開を行います。
左の一般的な頸動脈、外耳頸動脈、および周囲の結合組織から内頸動脈の枝を慎重に分離し、4.0シルク縫合糸を使用して外頸動脈および一般的な頸動脈を半ヒッチ結び目でリゲートし、一時的に内部頸動脈への血流を遮断する。0.1~0.12ミリメートルの厚さ11ミリメートルのシリコーンコーティング8.0シルク縫合糸を左中大脳動脈の原点まで内側頸動脈を通して挿入し、レーザードップラー流量計を使用して相対的な脳血流動脈の減少を測定します。挿入したフィラメントを血管に2時間固定し、脳動脈が閉塞している間に固定します。
閉塞期間の終わりに、フィラメントを慎重に引き出して、22時間の再灌流のために血流を回復させる。そして、3.0シルクの縫合糸を使用して、2つの半分のヒッチノットを持つ5つの場所で皮膚を縫合します。その後、麻酔薬の回復のためにそのケージにマウスを戻します。
再灌流終了から1時間後、体重GRex1キログラム当たり300ミリグラムを実験動物に投与し、経口ギャージのみで投与する。MCAOの発症後24時間、各実験動物の頭部の中皮膚に切開を行い、硬膜を剥がしながら斜め鉗子で頭頂骨を折る。慎重に頭蓋骨から脳を分離し、マウスの脳マトリックスを使用して、切除された組織を1ミリメートルの厚い部分に切断します。
標準プロトコルに従って、2%TTC溶液で17分間セクションを染色します。そして、デジタルカメラでサンプルをイメージングする前に、少なくとも2時間10%ホルマリンでセクションを修正します。次に、ImageJを用いて各セクションの脳梗塞領域を分析し、定量化します。
MCAO後の適切な実験時点で、各安楽死実験動物を10ミリリットルのPBSで経本的に穿刺し、続いて10ミリリットルのパラホルムアルデヒドを10ミリリットルずつ穿刺する。ちょうど実証したように脳を単離した後、収穫した器官を一晩で30%スクロースの10ミリリットルに浸す。翌朝、脳組織サンプルを最適な切断温度化合物に埋め込む。
そして、シロスタットの厚さ15マイクロメートルのセクションに組織をコロニラでスライスします。ガラススライド上のセクションをマウントし、1分間80%エタノールでセクションを水没させます。H&E染色の場合は、サンプルにヘマトキシリン溶液を5分間ラベルし、続いて1%の酸アルコールに2ディップを付けます。
次に、飽和炭酸リチウム溶液にスライドを30秒間浸し、続いて水道水で30秒間洗浄し、エオシン溶液で30秒間の対染色を行います。余分なエオシン溶液を水道水洗浄で取り除き、95%エタノールで1分間の上昇浸漬でスライドを脱水します。次に、スライドをエアドライし、少なくとも10分間キシレンでクリアし、カバースリップを取り付け媒体で取り付けます。
クレシルバイオレット染色の場合は、80%エタノール処理スライドをスライドウォーマーに少なくとも1時間置き、続いてクロロホルムで希釈した50%エタノールに浸漬します。翌朝、40度のドライオーブンで10分間0.1%クレシルバイオレットでスライドを染色し、続いて95%エタノールで30分間脱水し、2つの5分100%エタノール浸漬を行います。次に、スライド2つの5分間のキシレン浸漬をクリアし、続いて空気乾燥を行います。
次に、光顕微鏡による可視化用マウント媒体でスライドを取り付けます。シャム作動の正常なグループでは、脳梗塞は認められないが、一方、コントロールでは、未治療のMCAO動物は、損傷領域の比較的広い範囲が観察される。1キログラム当たり300ミリグラムGRex処理モデルマウスでは、損傷した組織の統計的に有意な減少が観察される。
H&Eおよびクレシルバイオレット染色組織切片の組織学的分析は、細胞生存の指標を提供する。実際、H&Eおよびクレシルバイオレット染色強度は、対照において有意に減少し、未治療のMCAO群は、シャム作動正常群に対してである。一方、GRex治療動物は、より大きな組織学的完全性を示し、対照、未治療および偽式の両方の群よりも少ない神経細胞死を意味し、虚血再灌流誘発脳損傷に対する抽出物の強力な神経保護効果を示唆する。
この手順を試みる間, この期間中に相対的な小脳血流を監視することを覚えておくことが重要です。.そして、プロセスの導体は、内皮層への損傷を最小限に抑えるために非常に慎重に
