この方法は、ベミシアタバチ、世界中の多くの国で野菜や観賞作物の生産に影響を与える侵略的な昆虫害虫の同定のための迅速かつ信頼性の高い診断ツールを提供します。その容易さから、この方法は、港湾や空港などの植物輸入品の入り口で現場で直接行うことができるため、取引ネットワークに沿ったベミシア・タバチの分散を減らす可能性があります。まず、はさみを使用して8チューブのLAMPストリップを2つの4チューブLAMPストリップにカットします。

次に、図1のテキストプロトコルに概説されているスキームに従ってチューブにラベルを付けます。この後、80反応のために十分なB.tabaci LAMP反応マスターミックスを準備します。次に、マスターミックスの22.5マイクロリットルを4管LAMPストリップの各チューブに分配します。

遠心分離機をパルスし、氷の上に置きます。素早く渦とパルス遠心B.tabaci LAMP PAC。次に、4管のLAMPストリップのそれぞれにPACとラベル付けされたチューブに2.5マイクロリットルを加えます。

次に、蓋を閉め、すぐに使用できるB.tabaci LAMPキットユニットをマイナス20°Cで保管します。DNA抽出を開始するには、滅菌爪楊枝を使用して、30マイクロリットルのDNA抽出溶液を含む0.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに昆虫標本を移管します。次に、ThermoMixer で摂氏 95 度で 5 分間、サンプルを 300 rpm に設定してインキュベートします。

簡単に渦とパルス遠心分離サンプル。すぐに使用できる B.tabaci LAMP キットの 1 つを解凍します。その後、キットを素早く渦巻き、それをパルス遠心分離します。

サンプルDNA抽出物を2.5マイクロリットルのS-OneチューブとS-2チューブに加えます。次に、2.5マイクロリットルの純アルカリDNA抽出液をNACチューブに加えます。ボルテックスとパルス遠心分離の後、キットをLAMP分析装置に挿入し、60分間摂氏65度で等温DNA増幅解析を行います。

同じ方法で、最初にキットを摂氏98度に加熱し、75°Cに冷却することで、DNA増幅産物の融解温度解析を行います。自動 LAMP 検証アプリケーションを使用して LAMP 読み出しを検証します。まず、[レポートの生成] ボタンをクリックする前に、ターゲットの種とテスト済みサンプルの数を定義します。

最後に、読み出しを検証アプリケーションの適切な入力フィールドに転送します。データを入力した直後に、検証の結果が表示されます。このプロトコルでは、通常のスイス輸入制御プロセスの過程で傍受されたB.TABACI昆虫標本をLAMPアッセイを介して分析した。

分析された80の標本から、75の標本が真陽性として正しく同定され、2つの標本が真陰性として正しく同定された。しかし、3つの標本は偽陰性であり、B.TABACIではないと誤って特定された。アッセイのサブセットは、チューリッヒ空港の植物保健検査官によって現場で行われました。

代表的な結果では、サンプル1と2は、約82°Cの予想アニーリング温度で約30分後にDNA増幅を介してB.tabaciとして正しく同定された。開発後、この方法は、ベミシア・タバチの迅速かつ実行しやすいオンサイト識別のための道を開きました。このプロトコルは、限られた検査訓練で植物の健康検査官によって実行することができるように設計されています。

植物輸入製品のスイスの入り口で方法のオンサイト検証に成功した後、この方法は他の植物病原体だけでなく、必要に応じて他のヒトまたは獣医の病原体にも適応することができます。