Este método fornece uma ferramenta de diagnóstico rápida e confiável para a identificação do Bemisia tabaci, uma praga invasiva de insetos que afeta a produção de vegetais e culturas ornamentais em muitos países ao redor do mundo. Devido à sua facilidade, o método pode ser realizado no local diretamente em pontos de entrada para produtos de importação de plantas, como portos e aeroportos, e tem, assim, o potencial de reduzir a dispersão do Tabaci Bemisia ao longo das redes comerciais. Para começar, use uma tesoura para cortar uma tira de lâmpada de oito tubos em duas tiras de lâmpada de quatro tubos.
Em seguida, rotule os tubos de acordo com o esquema descrito na figura um do protocolo de texto. Depois disso, prepare o suficiente b.tabaci LAMP reaction master mix para 80 reações. Em seguida, distribua 22,5 microliters da mistura mestre em cada um dos tubos das tiras LAMP de quatro tubos.
Centrífuga de pulso, e colocá-los no gelo. Vórtice rápido e centrífuga de pulso B.tabaci LAMP PAC. Em seguida, adicione 2,5 microliters no tubo rotulado PAC em cada uma das tiras DE LÂMPADA de quatro tubos.
Em seguida, feche as tampas e armazene as unidades prontas para uso do kit B.tabaci LAMP a menos 20 graus Celsius. Para iniciar a extração de DNA, use palitos de dente estéreis para transferir os espécimes de insetos para tubos de microcentrífugo de 0,5 mililitros com 30 microlitrais de solução de extração de DNA. Em seguida, incubar as amostras por cinco minutos a 95 graus Celsius em um ThermoMixer definido a 300 rpm.
Brevemente vórtice e pulso centrifugar as amostras. Descongele um dos kits de lâmpada b.tabaci prontos para uso. Em seguida, vórtice do kit rapidamente, e pulso centrífuga-lo.
Adicione 2,5 microliters de extrato de DNA de amostra aos tubos S-one e S-dois. Em seguida, adicione 2,5 microliters de solução de extração de DNA alcalino puro ao tubo NAC. Após o vórtice e a centrifugação de pulso do kit, insira o kit em um dispositivo de análise de LÂMPADA e realize a análise isotérmica de amplificação de DNA a 65 graus Celsius por 60 minutos.
Na mesma corrida, realize uma análise de temperatura de fusão dos produtos de amplificação de DNA, aquecendo primeiro o kit a 98 graus Celsius e esfriando-o a 75 graus Celsius. Valide a leitura da LÂMPADA usando o aplicativo automatizado de validação de LÂMPADAs. Primeiro, defina a espécie-alvo e o número de amostras testadas antes de clicar no botão Gerar Relatório.
Por fim, transfira a leitura para os campos de entrada apropriados do aplicativo de validação. Imediatamente após a inseção dos dados, o resultado da validação será exibido. Neste protocolo, os espécimes de insetos B.tabaci interceptados no curso do processo regular de controle de importação suíço foram analisados via ensaio LAMP.
De um total de 80 espécimes analisados, 75 espécimes foram corretamente identificados como verdadeiros positivos, e dois espécimes foram corretamente identificados como verdadeiros negativos. Três espécimes, no entanto, eram falsos negativos e foram incorretamente identificados como não sendo B.tabaci. Um subconjunto dos ensaios foi realizado no local por inspetores de saúde da fábrica no Aeroporto de Zurique.
Nos resultados representativos, as amostras um e dois foram corretamente identificadas como B.tabaci via amplificação de DNA após aproximadamente 30 minutos na temperatura esperada de ressarcimento de aproximadamente 82 graus Celsius. Após seu desenvolvimento, este método abriu caminho para uma identificação rápida e fácil de realizar no local do tabaci Bemisia. O protocolo é projetado de forma a ser realizado por inspetores de saúde de plantas com treinamento laboratorial limitado.
Após a validação bem sucedida no local do método em um ponto de entrada suíço para produtos de importação de plantas, o método poderia ser adaptado a outros patógenos vegetais, mas também, se necessário, a outros patógenos humanos ou veterinários.
