Bu yöntem, dünyanın birçok ülkesinde sebze ve süs bitkileri üretimini etkileyen bir istilacı böcek haşere olan Bemisia tabaci'nin tanımlanması için hızlı ve güvenilir bir tanı aracı sağlamaktadır. Kolaylığı nedeniyle, yöntem liman lar ve havaalanları gibi tesis ithalat ürünleri için giriş noktalarında doğrudan yerinde yapılabilir ve bu nedenle ticaret ağları boyunca Bemisia tabaci dağılımını azaltmak için potansiyele sahiptir. Başlamak için, iki, dört tüpLAMP şeritler halinde sekiz tüpLAMP şerit kesmek için makas kullanın.
Daha sonra, tüpleri metin protokolünün birinci yılında belirtilen şemaya göre etiketleyin. Bundan sonra, 80 reaksiyonlar için yeterli B.tabaci LAMP reaksiyon ana karışımı hazırlamak. Daha sonra, dört tüpLAMP şeritler tüplerin her içine ana karışımı 22,5 mikrolitre dağıtmak.
Nabız santrifüj, ve onları buza koy. Hızlı girdap ve darbe santrifüj B.tabaci LAMP PAC. Daha sonra, dört tüpLAMP şeritler her biri PAC etiketli tüp içine 2,5 mikrolitre ekleyin.
Ardından, kapakları kapatın ve kullanıma hazır B.tabaci LAMP kiti ünitelerini eksi 20 derecede saklayın. DNA ekstraksiyonuna başlamak için, böcek örneklerini 30 mikrolitre DNA çıkarma çözeltisi ile 0,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere aktarmak için steril kürdanlar kullanın. Daha sonra, 300 rpm ayarlanmış bir ThermoMixer 95 santigrat derece beş dakika boyunca örnekleri kuluçka.
Kısaca girdap ve nabız santrifüj örnekleri. Kullanıma hazır B.tabaci LAMP kitlerinden birini eritin. Sonra, kiti hızlı calıstırın ve nabız santrifüj.
S-1 ve S-2 tüplerine 2,5 mikrolitre numune DNA ekstresi ekleyin. Daha sonra, NAC tüpüne 2,5 mikrolitre saf alkali DNA ekstraksiyon çözeltisi ekleyin. Kiti girdap ve darbe santrifüj ettikten sonra, kiti bir LAMP analiz cihazına yerleştirin ve 60 dakika boyunca 65 santigrat derecede isothermal DNA amplifikasyon analizi yapın.
Aynı koşuda, kiti ilk olarak 98 santigrat dereceye ısıtarak ve 75 santigrat dereceye kadar soğutarak DNA amplifikasyon ürünlerinin erime sıcaklık analizini yapın. Otomatik LAMP doğrulama uygulamasını kullanarak LAMP okumasını doğrulayın. İlk olarak, Rapor Oluştur düğmesini tıklatmadan önce hedef türleri ve test edilen örnek sayısını tanımlayın.
Son olarak, okumayı doğrulama uygulamasının uygun giriş alanlarına aktarın. Verileri girdikten hemen sonra, doğrulama nın sonucu görüntülenir. Bu protokolde, İsviçre'nin düzenli ithalat kontrol işlemi sürecinde ele geçirilen B.tabaci böcek örnekleri LAMP analizi ile analiz edilmiştir.
Analiz edilen toplam 80 örnekten 75 örneği doğru olarak doğru pozitif olarak tanımlanmış ve iki örnek doğru olarak gerçek negatif olarak tanımlanmıştır. Ancak üç örnek yanlış negatifti ve yanlış olarak B.tabaci olmadığı tespit edildi. Tahlillerin bir alt kümesi Zürih Havaalanı'nda bitki sağlık müfettişleri tarafından yerinde yapıldı.
Temsili sonuçlarda, 1 ve 2'lik örnekler, yaklaşık 82 santigrat derecelik beklenen sıcaklıkta yaklaşık 30 dakika sonra DNA amplifikasyonu ile B.tabaci olarak doğru bir şekilde tespit edildi. Bu yöntem, geliştirildikten sonra Bemisia tabaci'nin hızlı ve kolay yerinde tanımlanmasının önünü açmıştır. Protokol, sınırlı laboratuvar eğitimi ile bitki sağlığı müfettişleri tarafından yapılabilen şekilde tasarlanmıştır.
Bitki ithalat ürünleri için İsviçre giriş noktasında yöntemin başarılı yerinde doğrulama sonra, yöntem diğer bitki patojenleri için adapte edilebilir, aynı zamanda, gerekirse, diğer insan veya veteriner patojenler için.
