Cette méthode fournit un outil de diagnostic rapide et fiable pour l’identification de Bemisia tabaci, un insecte ravageur envahissant affectant la production de légumes et de cultures ornementales dans de nombreux pays à travers le monde. En raison de sa facilité, la méthode peut être effectuée directement sur place aux points d’entrée pour les produits d’importation de plantes, tels que les ports et les aéroports, et a ainsi le potentiel de réduire la dispersion de Bemisia tabaci le long des réseaux commerciaux. Pour commencer, utilisez des ciseaux pour couper une bande LAMP à huit tubes en deux bandes LAMP à quatre tubes.
Ensuite, étiquetez les tubes selon le schéma décrit dans la figure un du protocole de texte. Après cela, préparez suffisamment de mix maître de réaction B.tabaci LAMP pour 80 réactions. Ensuite, distribuez 22,5 microlitres du mélange principal dans chacun des tubes des bandes LAMP à quatre tubes.
Pulsez la centrifugeuse et mettez-les sur la glace. Rapidement vortex et centrifugeuse d’impulsion B.tabaci LAMP PAC. Ajouter ensuite 2,5 microlitres dans le tube étiqueté PAC dans chacune des bandes LAMP à quatre tubes.
Ensuite, fermez les couvercles et rangez les unités prêtes à l’emploi du kit LAMPE B.tabaci à moins 20 degrés Celsius. Pour commencer l’extraction de l’ADN, utilisez des cure-dents stériles pour transférer les spécimens d’insectes dans des tubes de microcentrifugeuse de 0,5 millilitre avec 30 microlitres de solution d’extraction d’ADN. Ensuite, incuber les échantillons pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius dans un ThermoMixer réglé à 300 rpm.
Vortex et centrifugeuse d’impulsions brièvement les échantillons. Décongelez l’un des kits B.tabaci LAMP prêts à l’emploi. Ensuite, vortex le kit rapidement, et pulsez-le centrifugeuse.
Ajouter 2,5 microlitres d’extrait d’ADN échantillon aux tubes S-one et S-two. Ajouter ensuite 2,5 microlitres de solution d’extraction d’ADN alcalin pur au tube NAC. Après le vortex et le centrifugage d’impulsion du kit, insérez le kit dans un dispositif d’analyse LAMP, et effectuez l’analyse isothermale d’amplification d’ADN à 65 degrés Celsius pendant 60 minutes.
Dans la même course, effectuer une analyse de la température de fusion des produits d’amplification de l’ADN en chauffant d’abord le kit à 98 degrés Celsius et le refroidissant à 75 degrés Celsius. Validez la lecture LAMP à l’aide de l’application automatisée de validation LAMP. Tout d’abord, définissez l’espèce cible et le nombre d’échantillons testés avant de cliquer sur le bouton Générer le rapport.
Enfin, transférez la lecture vers les champs d’entrée appropriés de l’application de validation. Immédiatement après la saisie des données, le résultat de la validation sera affiché. Dans ce protocole, les spécimens d’insectes B.tabaci interceptés au cours du processus régulier de contrôle des importations en Suisse ont été analysés par voie d’analyse LAMP.
Sur un total de 80 spécimens analysés, 75 spécimens ont été correctement identifiés comme de véritables positifs, et deux spécimens ont été correctement identifiés comme de véritables négatifs. Trois spécimens, cependant, étaient de faux négatifs et ont été incorrectement identifiés comme n’étant pas B.tabaci. Un sous-ensemble des analyses a été effectué sur place par les inspecteurs de la santé des plantes à l’aéroport de Zurich.
Dans les résultats représentatifs, les échantillons un et deux ont été correctement identifiés comme B.tabaci par amplification d’ADN après approximativement 30 minutes dans la température prévue d’annealing d’approximativement 82 degrés Celsius. Après son développement, cette méthode a ouvert la voie à une identification rapide et facile à réaliser sur place de Bemisia tabaci. Le protocole est conçu de telle manière qu’il peut être exécuté par des inspecteurs de la santé des plantes avec une formation limitée en laboratoire.
Après validation réussie sur place de la méthode à un point d’entrée suisse pour les produits d’importation de plantes, la méthode pourrait être adaptée à d’autres agents pathogènes végétaux mais aussi, le cas dernier, à d’autres agents pathogènes humains ou vétérinaires.
