Este método proporciona una herramienta de diagnóstico rápida y fiable para la identificación de Bemisia tabaci, una plaga de insectos invasora que afecta a la producción de hortalizas y cultivos ornamentales en muchos países del mundo. Debido a su facilidad, el método se puede realizar in situ directamente en los puntos de entrada de los productos de importación de plantas, como puertos y aeropuertos, y por lo tanto tiene el potencial de reducir la dispersión de Bemisia tabaci a lo largo de las redes comerciales. Para comenzar, utilice tijeras para cortar una tira LAMP de ocho tubos en dos tiras LAMP de cuatro tubos.
A continuación, etiquete los tubos de acuerdo con el esquema descrito en la figura uno del protocolo de texto. Después de esto, prepare suficiente mezcla maestra de reacción B.tabaci LAMP para 80 reacciones. A continuación, dispensar 22,5 microlitros de la mezcla maestra en cada uno de los tubos de las tiras LAMP de cuatro tubos.
Centrífuga de pulso, y ponlos en hielo. Rápidamente vórtice y centrífuga de pulso B.tabaci LAMP PAC. A continuación, agregue 2,5 microlitros en el tubo etiquetado PAC en cada una de las tiras LAMP de cuatro tubos.
A continuación, cierre las tapas y guarde las unidades del kit B.tabaci LAMP listas para usar a menos 20 grados centígrados. Para comenzar la extracción de ADN, utilice palillos de dientes estériles para transferir los especímenes de insectos a tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitros con 30 microlitros de solución de extracción de ADN. Luego, incubar las muestras durante cinco minutos a 95 grados Celsius en un ThermoMixer establecido en 300 rpm.
Brevemente vórtice y centrifugar pulso las muestras. Descongele uno de los kits B.tabaci LAMP listos para usar. A continuación, vórtice el kit rápidamente, y el pulso lo centrifuga.
Añadir 2,5 microlitros de extracto de ADN de muestra a los tubos S-uno y S-dos. A continuación, agregue 2,5 microlitros de solución de extracción de ADN alcalino puro al tubo NAC. Después de la centrifugación de pulsos y vórtices del kit, inserte el kit en un dispositivo de análisis LAMP y realice análisis de amplificación de ADN isotérmico a 65 grados centígrados durante 60 minutos.
En la misma carrera, realice un análisis de temperatura de fusión de los productos de amplificación de ADN calentando primero el kit a 98 grados Centígrados y enfriándolo a 75 grados centígrados. Valide la lectura LAMP mediante la aplicación de validación LAMP automatizada. En primer lugar, defina la especie objetivo y el número de muestras probadas antes de hacer clic en el botón Generar informe.
Por último, transfiera la lectura a los campos de entrada adecuados de la aplicación de validación. Inmediatamente después de introducir los datos, se mostrará el resultado de la validación. En este protocolo, los especímenes de insectos B.tabaci interceptados en el curso del proceso regular de control de importaciones suizos fueron analizados a través del ensayo LAMP.
De un total de 80 especímenes analizados, 75 especímenes fueron identificados correctamente como verdaderos positivos, y dos especímenes fueron identificados correctamente como verdaderos negativos. Tres especímenes, sin embargo, eran falsos negativos y fueron identificados incorrectamente como no ser B.tabaci. Un subconjunto de los ensayos fue realizado in situ por inspectores de salud vegetal en el aeropuerto de Zúrich.
En los resultados representativos, las muestras uno y dos se identificaron correctamente como B.tabaci a través de la amplificación del ADN después de aproximadamente 30 minutos en la temperatura de recocido prevista de aproximadamente 82 grados centígrados. Después de su desarrollo, este método allanó el camino para una identificación rápida y fácil de realizar in situ de Bemisia tabaci. El protocolo está diseñado de tal manera que puede ser realizado por inspectores de salud vegetal con formación limitada en laboratorio.
Después de la validación in situ exitosa del método en un punto de entrada suizo para los productos de importación de plantas, el método podría adaptarse a otros patógenos vegetales, pero también, si fuera necesario, a otros patógenos humanos o veterinarios.
