We thank Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) for the original protocol and assistance in initial setup and members of the Lei laboratory for critical reading of the manuscript. This work was funded by the Intramural Research Program of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.

1.サイクルの開始：胚を播種注：サイクルは、前のサイクルから収集した材料の1.5グラム（胚および/またはいくつかの1齢幼虫からなる混合物）で始まります。この材料は、蛹の段階までアクティブ酵母混合物を用いてプラスチック容器（特定の材料/機器の表を参照）に配置されます。コンテナは、幼虫が脱出することができます回避するために、蓋付きの胚および幼虫の生物学的混合物の導入後に閉じられます。空気の循環を可能にするために蓋に穴を作る必要があります。スルーホール幼虫の脱出を回避するには、フォームのプラグが使用されています。最後に、漂白剤で汚れや染色の服を避けるために、このセクションではなく、全体のプロトコルだけでなく、手袋、白衣を着用することをお勧めします。 <ol><li>プラスチック容器を設定します。 <ol><li>のプラスチック製容器蓋にカミソリの刃で3正方形の穴を作りますpproximately 2.2センチメートル。発泡栓（50×55ミリメートル、DXL）のためのタイトなフィット感を確保し、各穴に1泡プラグを配置するために、各穴の四隅にテープ（3/4インチ表示用テープ）を追加します。 </li><li>プラスチック製のラップでプラスチック容器の内部をカバーしています。この膜上に、プラスチック容器の底部をカバーするために、綿の層を追加します。指で綿を引き裂きます。 </li></ol></li><li>フライ食品を準備します。 <ol><li> 500ミリリットルのビーカーに脱イオン水333ミリリットルを追加します。磁気棒を入れたビーカーを攪拌しながら、原液（99.96パーセントと85パーセント、それぞれ）から、プロピオン酸の167μlのリン酸の1.08ミリリットルを追加します。 </li><li>ゆっくりと大きな塊を避け、活性乾燥酵母の77.5グラムを追加します。乾燥酵母を溶解させた後、ショ糖の38.8グラムを追加します。 注：スクロースはすぐにこのコンポーネントを追加した後、発酵が開始されますので、追加する最後の成分であるべきです。 </li></ol></li><li>すぐにスクロースを溶解させた後、注ぎます綿の上に食べ物、そして均等に綿をカバーするようにしてください。食品を汚染し、実験室の中にエスケープハエを避けるために蓋付きプラスチック容器を閉じます。 </li><li> 70％エタノール5mlと前のサイクルから回収胚（dechorionatedない）を1.5gを懸濁。半分にカット2濾紙、スパチュラまたは（必要に応じてカット）広い先端との転送ピペットを用いて4個に均等に生物学的混合物を配布します。浸した綿の上に濾紙を置き、ふたを閉めます。最後に、蛹期までプラスチックRTでコンテナ（24ºC）、湿度（35％）をインキュベートします。 注：プラスチック容器は、そうでなければ、これは細菌の増殖を促進する、湿ったチャンバ内に配置すべきではありません。 </li></ol>サイクルの2継続：胚からハエに。 注：サイクルのこの部分は、9日後に成虫が出てくる時まで、1日目にプラスチック製の容器に入れた胚から行きます蛹から。これらの8日間は何も実行する必要がありませんが、胚が羽化するまで、 ショウジョウバエのライフサイクルの次のステージに正しく進行していることを監視します。幼虫が死んこの間黒を回して起動した場合、発泡プラグはあまりにもタイトではなく、その十分な換気が提供されていることを確認してください。この期間は、前のサイクルからフライ人口ケージをきれいにする良い時期です。 <ol><li>成人女性は、フライ食品（ステップ3を参照）にそれらを堆積した後に観察した胚は、1 番目の齢幼虫24の周りの時間になります。得られた幼虫は成長しており、第2および第3齢幼虫に二回脱皮、4日の間にステップ1で調製したフライ食品から送ります。 </li><li>フライ人口ケージを清掃してください。 <ol><li>ハエの活性を遅くするために、少なくとも30分間、4ºCでケージを置きます。ケージの一方の側を覆っているネットを削除し、高速移動に伴って、大規模なバイオハザードプラスチックで開放側をキャップバッグ。袋にケージの内容を注ぎます。 </li><li>バイオハザードバッグはまだケージの1側を覆うとともに、バイオハザードバッグ側を下にして、シンクの上に垂直にケージを置きます。慎重に逃げるのハエを防止し、バイオハザード廃棄物容器に廃棄するビニール袋を取り外します。 </li><li>慎重に、小さな穴を作成流しにハエを洗いますと水とケージの内部を洗浄するために十分な上部のネットを開きます。ゆっくりと穴のサイズを大きくし、ケージ内のすべてのハエをなくします。 </li><li>水と石鹸でケージとの両方のネットを清掃してください。ネットはまだ湿っているが、ドライクリーンケージの両側にそれらを確保し、最終的にケージに付着するステップ1.1.2で作製したプラスチックフィルムを防ぐことができますラボ浸す紙、内側に置きます。今、ケージは次のサイクルの準備ができています。 </li></ol></li><li>四日間の初期セットアップ後、幼虫の蛹化を観察します。幼虫は4日間以上、この段階のままになります。 注：Duringこのフェーズは、蛹は、プラスチック容器の内部全体を綿の表面をカバーします。 </li><li>蛹期の間と最初のハエが出現する前に、プラスチック容器を開き、きれいな人口ケージの中にラボ浸す紙の上のすべての蛹と綿を含むプラスチックフィルムを配置します。ダブルノットでネットを閉じ、プラスチック容器、次のサイクルのためのふたを清掃してください。 注：蓋に取り付けられた蛹は破棄され、オートクレーブまたは羽化する前に凍結によって破壊されるべきです。 </li></ol> 3.アダルトハエ。 注：蛹期の4日後、最初のハエがさなぎから出てきます。 24内 - 48時間すべてのハエがeclosedている必要があります。サイクルのこの部分では、再生のための適切な環境づくりを目指して彼らに食べ物を提供することが重要です。 <ol><li>糖蜜トレイを準備します。 <ol><li> 1リットルのフラスコに脱イオンH 2 Oの556.25ミリリットル、糖蜜の90ミリリットル、及び寒天の22グラムでコンバイン。クールな30分間攪拌棒、オートクレーブし、95％エタノールで10％Tegoseptの9.25ミリリットルを追加します。 </li><li> 21のx 14.5センチメートルの肉トレイに混合物を注ぎます。 17トレイ - ボリュームは15をカバーするのに十分であることを確認してください。固化し、乾燥を避けるために、プラスチックフィルムで各トレイをカバーするために20分 - 10待ちます。 1 Lのいくつかのフラスコを同時に製造することができます。必要になるまでプラスチックに包まれた4ºCで糖蜜トレイを保管してください。 </li></ol></li><li>大人のハエとケージの中に濡れた酵母で覆われた糖蜜トレイを追加します。 <ol><li>プレートを追加する前に、30分間の低温室で4ºCでケージを置きます。 </li><li>ビーカーに脱イオンH 2 Oの200ミリリットルを加え、スプーンで撹拌しながら、ゆっくりと乾燥酵母を注ぎます。混合物は、約食品に立ち往生ハエを防ぐために、ピーナッツバターの一貫性になったときにドライイーストを加える停止します。 注：食品の溶液は、カバーすることは非常に困難であろう他の方法で凝固させないことが重要です糖蜜は（セクション4.3を参照）トレイと収穫プロセス中に卵を抽出します。 </li><li> 1糖蜜トレイからプラスチックフィルムを取り外し、スプーンまたはスパチュラを用いて新たに調製したウェット酵母の層でそれをカバーしています。表面全体が覆われていることを確認してください。 </li><li>ケージが冷たい部屋に入れたまま、ネットを開き、慎重にケージに濡れた酵母と糖蜜トレイを追加します。ネットを閉じて、RTでケージを置きます。 注：挿入中に空の肉のトレイにプレートをカバーするのに有用であることが、糖蜜トレイにハエのアクセスをブロックしないようにしてください場合があります。 </li></ol></li><li>乾燥しすぎ得るために酵母を避けるために、48時間 - 食品皿ごとに24を変更します。大人のハエは、乾燥に非常に敏感です。 </li></ol>サイクルの4終了：胚を収穫注：最高のフライの肥沃度が3 - 5日羽化後。したがって、この時間の間に収穫は最高の胚の収量を取得します。希望のコレクションはcompleされた後テッドは、サイクルが終わりました。ハエが犠牲にされるべきであり、ケージがステップ2.2で指定されるように洗浄します。 <ol><li>セクション3.2.5で説明したように一般的に、2日間フライ羽化後、ケージに新鮮なウェットフードを使用して新しい糖蜜トレイをご紹介します。卵堆積の収率を増加させるために、指の助けを借りて、できるだけ湿潤酵母の表面のような不規則します。古い食品トレーがケージの中に存在する場合、新しいプレートを追加する前に、慎重にそれを削除し、バイオハザードバッグにそれを捨てます。収量を増加させるための別のチップは、すべての卵が食品に敷設されるように綿の層を除去することです。 RTでケージを維持します。 </li><li>小さな白い点として胚を観察します。 注：卵を収集する準備ができています。フライケージの定期的なメンテナンスのために、2日間のコレクションが推奨される時間です。このコレクションは、主に胚および少数の1 番目の齢幼虫が含まれています。様々なコレのための収穫胚の典型的な収量のための代表的な結果を参照してください。ction時点。 </li><li>胚を収穫<ol><li>約30分間の低温室でケージを置きます。セクション1で説明したようにその間に次のサイクルのためのプラスチック容器やフライ食品を準備します。 </li><li> 8 Lのオートクレーブトレイで、総容量の1/4まで水を追加し、10％トリトンX-100の1ミリリットルを追加します。ケージは低温室でありながら慎重に糖蜜プレートを取り外し、バイオハザードバッグの内側に配置します。 </li><li>袋からトレイを取り外し、すぐにそれを沈めるオートクレーブトレイの洗剤溶液中で（逃げるのハエを防ぐため）。バイオハザードバッグを閉じて、バイオハザード容器に入れ。ハエは、洗剤を含まない水に溺れないであろう。 </li><li>糖蜜のオフ胚および酵母を洗浄するために大規模な絵筆と蒸留水の銃を使用してください。バイオハザードボックスにプレートと糖蜜を捨てます。 </li><li> 3ふるいセット（上部の粗いふるい30、真ん中に40と底部の100）を介して慎重にソリューションを注ぎます。ウォッシュ塊Onは蒸留水銃を持つトップレベルには塊がなくなるまで。 注：大人のハエと第3齢幼虫はふるい30に保持されます。 <ol><li>蒸留水でオートクレーブトレイをすすぎ、ふるいを通してすすぎ水を注ぎます。トップふるいを削除し、酵母塊が残っている場合、プロセスを繰り返します。 1 番目と2 番目の齢幼虫のすべてのほとんどは、篩40のままになります。 </li></ol></li><li>第2のシーブを削除してください。第三（下）ふるいで黄色がかった材料は、胚および小1 番目の齢幼虫の混合物です。ふるいの片側にすべての卵を移動するために、蒸留水の銃を使用してください。スパチュラでそれらを収集し、それらの重量を量ります。 </li><li>これらのサイクルの間の胚/幼虫の回収収率は7と13グラムの範囲です。新しいサイクル（セクション1）を起動するには、この材料の唯一の1.5グラムを使用してください。更なる処理のための胚の残りの部分を使用するか、廃棄することができます。 </li></ol></li></ol> 5.さらに、処理注：人口の継続のために利用されない胚を実験のために直ちに使用することができるか、あるいは-80ºCで凍結することができます。両方のオプションについては、胚は最初にdechorionatedする必要があるかもしれません。 <ol><li> dechorionationについては、50％の漂白剤溶液中で2分間胚を洗浄し、蒸留水でよくすすぎます。 </li><li>ペーパータオルで強く押して胚、第1のドライ、凍結した後、15または50ミリリットルコニカルチューブに、へらの助けを借りて、それらを比較検討し、配置します。最後に、数秒間、液体N 2にコニカルチューブを沈めます。 </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

材料1の1.5グラムで起動すると、サイクルごとに7と13グラムの間に収集された胚の収率を得ることができます。そのような材料の量を得るためには、フライサイクルのすべての段階のための右の培養条件を維持することが重要です。 最も重要なパラメータは、それぞれ、24ºC35％であるべきである温度及び湿度です。これら2つのパラメータは、実験室の通常の環境下で一定に保つことができない場合、一つの可能​​性は、インキュベータまたは環境室にフライケージを配置することであろう。他のプロトコルは産卵9,10の収量を増加させるために70％の湿度も一定の24時間の明暗サイクルをお勧めします。しかし、35％の周りの湿度を維持することは細菌汚染を回避し、このプロトコルの目的は、人口のケージのメンテナンスだけであるため、ハエは、ラボの通常の光環境に保存されています。 もう一つ重要な点は、ジを維持することです大人へのsturbancesはできるだけ低く飛びます。他のハエからの交差汚染を避けるために、フライ部屋から別の場所にケージを保つことが望ましいことがあります。 それは彼らの純度を維持するために、彼らは大規模な人口ケージ14に顕著な異常な交尾行動を示すことが非常に困難であるため、トランスジェニックおよび変異ハエの大集団の培養は、推奨されません。 一つの可能性のある問題は、大量にショウジョウバエを培養しながら、食品のために競うため、生産卵の収量を減少させるダニおよび/ ​​またはカビのような他の生物の存在です。これを避けるために、きれいなすべての機器を維持するために非常に重要であるケージを洗浄し、ネット、水と石鹸でボックスを飛ぶし、すべてのサイクルの後に使い捨て材料（発泡栓）を廃棄します。ステップにおいてフライ食品を製造する場合、金型成長を減少させるために、プロピオン酸およびリン酸が湿潤酵母に添加します1.2とTegoseptステップ3.1で糖蜜トレイを準備します。時間が短く、材料はすぐに洗浄することができないときに-20℃で、このようなプラスチックの箱や篩などの材料を配置することも、役に立つ場合があります。 胚はフライボックスに播種し、最後の収集日で終了したときに開始、15日 - コレクション全体のサイクルが14で起こります。この間、プロトコルセクションで詳述人口フライケージ（ 図2）、の維持に必要なすべてのステップを覚えておくために、スケジュールを整理することをお勧めします。成虫が出現するまで卵は、播種することを日から、唯一のプラスチックの箱を検査する必要があり、蛹化が発生したときに、ケージの内側に配置します。胚は新しいサイクルのために播種するまで3日 - その後、ハエは、すべての2を供給しなければなりません。全体のプロトコルでは、最も長い日が新しいサイクルを開始するための胚の収集および播種の間にあります。 A5日大人の羽化後、最後に2日後に低下 - プロトコルにコメント秒、最高の卵の収量は3です。これは、卵の収穫が実行される中で一日を選択するために私たちにいくつかの柔軟性を提供します。 収集された胚の収率は所望の出発量（1.5グラム）未満の何らかの理由により、1は常に新しい糖蜜トレイを追加し、次の日より多くの卵を集めることができます。一定のコレクションのために、並列に2ケージを維持するために推奨され、そして胚のより高い量が必要な場合、また、大きなケージを使用することが可能です。短時間のコレクションを行う場合には、収量を増加させる一つの方法は、午前中に産卵バーストを利用することです。 種々の発生段階を大量に収集する多くの利点があります。例えば、人口のケージから収集した胚は、免疫沈降アッセイ6-8、質量collectioで非常に首尾よく使用されてきました解離した幼虫から幼虫組織のnが3C実験4およびRNA調製15のための非常に良い源であることが実証されていて、大人のハエからのヘッドはChIP実験16のために利用されてきました。また、成人は、しばしば、組織培養用17ハエ抽出物を作るために必要とされます。 ケージの最も有望な用途の一つは、病原体、生体分子、化学物質及び電離放射線の暴露に応答した遺伝子、転写産物、タンパク質および代謝産物の分析及びスクリーニングを可能にするハイスループットアッセイのための材料を提供することにあります。これらの大規模アッセイにおいて個体の多数が必要とされており、ここで説明するハエ集団ケージは、その分析およびスクリーニング18のためのショウジョウバエのライフサイクルの異なる段階中に材料の大きな量を得るために非常に有用であることができます。

遺伝的および生化学的ア ​​プローチを組み合わせる能力は、 ショウジョウバエを生化学および分子生物学的研究1-3に特に適した生物を行いました。これらの研究は、多くの場合、大人のハエから、だけでなく、幼虫4、蛹5および胚6-8からだけでなく、生物学的材料を大量に必要とします。大量の材料を得るために、研究者は、フライ「人口ケージ」として知られている大きな容器を用いて培養ハエを持っています。これらのケージは、ハエが逃げることなく、ケージの中に食品の導入を可能にするために、両側のネットで覆われたプラスチック製の円筒で構成されています。これらのケージは、（特定の材料/機器の表を参照）9-11自家製や会社から購入することができます。 ハエの大量の成長を、このシステムを使用することの主な利点は、果物のサイクル12を飛ぶすべてのハエは、再で開発する方法で制御することができるということですlatively方法を同期。この同期は、新しい胚を播種幼虫/ハエを供給し、正確な時刻に大人のハエを犠牲にすることによって達成されます。同期ハエ集団を使用すると、発生研究13のために特に有用です。 いくつかのハエからの新しい人口ケージの開始が増幅9-11の多くのサイクルを必要とする時間のかかるプロセスです。でもフライ培養ボトルまたはminicagesのような大きなコンテナを使用して、全体のプロセスは数ヶ月続くことができます。ステップを消費し、この時間を回避するために、多くのショウジョウバエの研究室は、定期的に、このようなケージを維持します。すでに確立された人口ケージから胚コレクションから始まる新しいケージを開始することが最も便利です。一般的に、ほとんどのラボではこの原稿がフライ人口ケージを維持するための詳細なプロトコルを提示するようにオレゴンRやカントンSなどの野生個体群のケージを、維持します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity practical cotton roll</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry yeast</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>23540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>1001-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam tube plugs</td>
			<td>Jaece</td>
			<td>L800-D2</td>
			<td>50 mm Diameter x 55 mm Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly population cage</td>
			<td>Flystuff</td>
			<td>59-116</td>
			<td>9&#8243; Diameter x 14.4&#8243; Length. Includes the nets for the cage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meat tray</td>
			<td>Genpak</td>
			<td>1002S (#2S)</td>
			<td>8.25 x 5.75 x 0.5 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molasses</td>
			<td>Grandma&#180;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic container</td>
			<td>Rubbermaid</td>
			<td>4022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic film</td>
			<td>Glad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S 93326</td>
			<td>Toxic. Handle in Chemistry Hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A258-500</td>
			<td>Toxic. Handle in Chemistry Hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel&#160; sieve #100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>57324-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel&#160; sieve #40</td>
			<td>VWR</td>
			<td>57324-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel&#160; sieve #30</td>
			<td>VWR</td>
			<td>57324-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>MP</td>
			<td>152584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegasept</td>
			<td>LabScientific</td>
			<td>FLY5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maintenance of a drosophila melanogaster population cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

フライケージ集団の維持は、ハエのライフサイクルに基づいています。したがって、プラスチック容器に（ 図1A）胚および幼生の初期生物学的混合物を配置した後、受精卵は、これ以上の2日以内に幼虫になりますし、幼虫は4日間増殖し、比較的（異なる齢幼虫の段階を経て同期） 図1Bを参照してください。 幼虫は第3齢幼虫の段階を完了した後、彼らは蛹になると蓋（ 図1C）の内部表面上のいくつかのプラスチック容器内の綿の表面をカバーします。ハエは変態のプロセスを終了するまで、この蛹期間は、次の4日間のために行くだろう。この期間中に強くケージにハエを転送することをお勧めします。後に10 - 最初の成虫は9日目に孵化するために開始されますそれらのすべてのサイクル（ 図1D）の日11による開始は蛹から浮上しているだろう。 5日羽化（13日目〜15）の後、最終的に17日目の下落（7日羽化後） - 胚コレクションの最高の収量が3得られます。したがって、13日目での生鮮食品の最後のトレイを追加し、15日目の卵（ 図1EおよびF）を収集することをお勧めします。これは、胚の最大数の収集を可能にします。 表1は、各サイクルで1.5グラムの出発物質で、6つの連続サイクルコレクションの収率を示している。食品が乾燥しすぎている可能性があり、その結果、収集した胚の収率が減少する収集する前に三日余分を追加し、 図2全サイクルの収集のための推奨される予定です。 2日に収穫物60;期間は、主に胚から構成されています。しかし、幼虫の数が少ないにも存在します。ケージのメンテナンスのために、これらの幼虫は、非同期のある程度が期待されているので、問題はありません。それにもかかわらず、いくつかの生化学的実験のために、これらの胚の純度は非常に重要であるが、同時にこれらの実験を実行するために卵を大量に収集するためにも必要です。この理由のためにいくつかの短い連続したコレクションを迅速に室温で食品と新しいプレートを追加した後、この方法で得られる収率および純度の評価を提供するために、1時間、3時間で行った（ 表2および図3） 。 1時間の連続した​​コレクションは、非常に低い収率（14.5 mg）を用いて開始したが、その後胚の量は毎回収集が、最後の時間のために増加しました。最初は低い収率は、食品を変更したが、後に順応する過程で強調されているハエに起因する可能性があります。一方、LARありませんVAEは、より短いコレクションは高純度をもたらすことを示し、5シーケンシャルコレクション（ 図3A）で観察されました。綿がケージから削除されていない場合は、以前の時点から幼虫可能性が新鮮なプレートが増加されたままとなります。綿が削除された場合であっても、時間に幼虫は、ケージの側面にさまようし、収集中に食べ物を入力します。 3時間連続したコレクションの場合、収量は840から約1時間のコレクションで得られる収率よりも10倍以上である1250 mgの、の範囲でした。これらの胚の純度は100％（ 図3B）の近くにありました。時折幼虫が観察されました。いくつかの発達の研究では、収集された胚のための非常に厳格な同期を必要とします。条件が理想的ではない場合、女性はより成熟した卵を保持し、堆積することができるので、同期の純度を高めるためには、最初のコレクションプレートを破棄することをお勧めします条件は、このような新しいプレートの導入と同様に、改善メートル。また、高齢者のハエ（&gt; 6日）が少ない同期胚を作り出​​すことを知っておくことが重要です。高精度の同期の程度を確認するために、収集された胚のDAPI染色をお勧めします。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53756/53756fig1.jpg" /> 図1. フライ人口ケージ内の キイロショウジョウバエ のライフサイクルは、サイクルの（A）開始はプラスチックの箱の容器に胚の1.5グラムを播種します。基準として、下のパネルでは、フィルタ紙の長さ8.5 cmです。 （B）幼虫は比較的5日サイクルの開始後に同期し成長しています。 8日目において（C）は 、ハエのほとんどは、蛹の段階にあります。 B（B &#39;）とCで下パネル<html> （C &#39;）は 、上部のパネルで示された領域の倍率です。 （D）大人のハエは、10日周期の開始後に蛹から現れました。 （E）大人の胚を収集するプロセスを開始する前に、人口のケージの内側に飛ぶ、15日目でのフライ食品に黄色がかった材料は、受精卵です。 100粗いふるいの底に収集された（F）胚（およびいくつかの幼虫）は、全体のケージサイクルの後。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53756/53756fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53756/53756fig2.jpg" /> 図2.全サイクルの収集スケジュール。図2は、完全なサイクル・コレクションの推奨スケジュールを示しています。<html>トン= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53756/53756fig3.jpg" /> 1時間、3時間連続したコレクションの図3.純度。1時間（A）で収集した胚や食品の新たなトレイを追加した後3時間（B）の代表的な画像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53756/53756fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table><tbody><tr><td> サイクル数 </td><td> 収量（G） </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 9.5 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 12.7 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 7.1 </td></tr></tbody></table>。 &quot;FO：=-together.within-ページ保つ」ntent。 いくつかのサイクルコレクションの 1&quot;&gt; 表1 収量を 表1に、1.5グラムの出発物質で、6つの連続サイクルコレクションの収量を示し、各サイクルでは、最後の食品のトレーは、13日目に添加し、収穫は15日目に行われました。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> コレクション＃ </td><td> コレクションの長さ（時間） </td><td> 収量（mg）を </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 14.5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 21.6 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 56.1 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 1 </td><td> 160.1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 106.1 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 960 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 840 </tD&gt; </tr><tr><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 1250 </td></tr></tbody></table> 表2 1時間、3時間連続コレクションの収量 。 表2は、新たな糖蜜プレートを配置した後、新しい食品と3回連続コレクション3時間を追加した後、1時間5回連続コレクションの収率を示しています。

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Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

のメンテナンス<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;人口ケージ

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

13.1K ビュー.  National Institutes of Health. This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

ビデオ: Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

キイロショウジョウバエの幼虫中枢神経系の解剖

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

生物学

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

アダルトキイロショウジョウバエのロコモーションの高解像度のビデオトラッキング

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

幼虫のモニタリングの心機能キイロショウジョウバエ生理学的研究のための

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

大人からOenocytesの解剖キイロショウジョウバエ</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

の分離キイロショウジョウバエ精巣

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

の定量的比較シス</emトランスジェニックで> -調節エレメント（CRE）の活動キイロショウジョウバエ</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

における寿命の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

の蛹ケースを画像化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

解剖や成虫の免疫染色から<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...