血管新生に対する天然物の影響を評価するHUVECチューブ形成アッセイ

チューブ形成アッセイは、新しい血管の形成につながるいくつかのステップの根底にある分子メカニズムを研究するためのインビトロテストです。このアッセイは、血管新生に関連する化合物およびシグナル伝達カスケードを同定することを可能にする。1つのテストでは、RGWEのような天然化合物が内皮細胞がチューブ状の構造を形成する能力を低下させ、細胞の生存率に影響を与えないことを示し、この効果はMEK/ERK経路の活性化に依存することを示すことができる。正しい数のセルでテストを行うことが重要です。実際には,細胞が少なすぎるか、または多すぎる細胞は、チューブの正しい形成を許しませんでした。このため、正しい数のセルを見つけるために予備テストを行うことをお勧めします。ルカ・オルガ・パストリーノ博士(私の研究室の博士課程の学生)が手順を紹介します。まず、春と夏の間にRutaの砂利の葉を収集します。250グラムのみじん切り葉を円錐形のフラスコに入れ、原稿に記載されているように、蒸留水、沸騰、フィルターを1リットル加えます。翌日、凍結乾燥剤を使用して葉エキスを凍結乾燥させる。粉末を得た後、それを計量し、アリコートに分割します。テキストプロトコルに従って、内皮細胞増殖培地中のHUVECを培養する。細胞が80%の合流度に達すると、細胞を1〜3の割合で通過させる。通過2と通路5の間に得られた細胞を使用する。通過したHUVECが70%の合流度に達したら、目的の遺伝子を含むベクターの1マイクログラムでそれらをトランスベクトします。細胞にトランスベーション溶液を加え、摂氏37度、二酸化炭素5%で細胞をインキュベートします。トランスベクションの3時間後、新鮮な完全培地を7ミリリットル加え、さらに24〜48時間培養します。地下準備の直前に、冷やした96ウェルプレートを氷の上に置き、各井戸に50マイクロリットルの冷たいマトリックスを加えます。プレートがインキュベートしている間、1ミリリットルのPBS/EDTA溶液でHUVECを洗います。その後、細胞に1ミリリットルのトリプシン-EDTA溶液を加え、摂氏37度で5分間インキュベートし、浮遊細胞を含む培地を回収し、遠心分離を介して細胞を収穫する。次いで、細胞をPBSの1ミリリットルで再懸濁する。細胞懸濁液の0.2ミリリットルをトリパンブルー溶液で0.5ミリリットルのPBSに移します。懸濁液を室温で5分間保持した後、B内の細胞を数える