この方法は、神経サブタイプを分類し、皮質回路の機能的な地図の理解を広げるのに役立ちます。このプロトコルは、ニューロンの超構造を維持し、樹状および軸索の両方の優れた回復を得るために最適化されており、高品質の再構築が可能です。電気生理学的記録の最後に、記録された細胞を含むスライスをACSFの小皿に移す。
ヒュームフードで作業している間、細かい品質のフィルターペーパーの小片にスライスを転がし、スライスに湿らせたろ紙の別の部分を置きます。5~10ミリリットルの固定液を含む小さなプラスチック製の鍋に組織を入れ、一晩摂氏4度で保管します。翌日、固定溶液を含む容器から0.1モルリン酸緩衝液の2ミリリットルの容器に組織を移してすすぎ、メスの刃で余分な組織を切り取ります。
ペトリ皿にスライスを入れて余分な組織を取り除き、メスの刃で余分な組織を切り取ります。トリミングしたティッシュをきれいなペトリ皿に移し、折り目や折り目のない平らであることを確認します。乾いたペイントブラシを使用して余分なバッファを取り除きます。
組織を温かいゼラチン溶液で覆い、ペトリ皿を冷凍ブロックに置き、溶液を素早く冷却します。その後、ゼラチンを摂氏4度に設定した皿を30~60分間動かします。ヒュームフードでは、メスの刃を使用してゼラチン埋め込み組織を含む小さな1 X 1センチメートルブロックを切り取ります。
小さなへらを使用してブロックを持ち上げ、慎重に新鮮な固定溶液に移します。摂氏4度で少なくとも30分間固定してください。この2回目の固定に続いて、ゼラチンブロックを5ミリリットルのPBで3回洗います。
洗浄後、紙のティッシュを使ってブロックを乾かします。その後、スーパー接着剤を使用してビブラートトラックに、上部の組織と向きのブロックを貼り付けるために、シアノアクリル接着剤の少量を使用しています。ビブラートメを使用して50ミクロンの厚さのスライスを切り離し、各セクションを10%のスクロースを含むガラスバイアルに慎重に入れます。
切開後、バイアルから慎重にセクションを取り出し、ペトリ皿の蓋に平らにします。その後、セクションの周りからゼラチンを削除するために新鮮なメスの刃を使用しています。PBで新鮮な10%のスクロースを2ミリリットル含むバイアルにセクションを入れ、10分間攪拌して凍結保護プロセスを開始します。
凍結保護に続いて、ペンキブラシを使用してアルミニウム箔の小さな長方形の上に平らにセクションを置きます。セクションから余分な液体を取り除き、慎重に小包にホイルを折ります。アルミ箔を液体窒素の表面に近づけて、表面に触れることなく30秒間保持します。
そして、セクションを約30秒間完全に解凍します。さらに2回、凍結解凍を繰り返します。塗料ブラシでホイルからすべてのセクションを取り除き、一定の攪拌の下で余分なショ糖を洗い流すためにPBの2ミリリットルを含むガラスバイアルに入れます。
蛍光イメージング用の免疫染色後、スライドをPBSを含むガラスペトリ皿に入れ、カバースリップを慎重に取り外します。その後、パスツールピペットからPBSの穏やかなパルスを使用してスライドからセクションを洗い流します。セクションをPBSを含むきれいなガラスバイアルに入れます。
アビジンHRP反応を、まずアビジンビオチン複合体またはABC中のセクションをインキュベートすることにより、HRP反応生成物を増幅するために少なくとも2時間実施する。次に、PBSで3回10分間洗浄し、トリスバッファーを2回10分間洗浄します。最後のトリスバッファー洗浄を取り除いた後、迅速にジアミノベンジジン溶液またはDAB溶液に8%の塩化ニッケル溶液の1滴を追加します。
次に、溶液を混合し、セクション上にこの溶液の1ミリリットルを迅速に追加するために、溶液を入れおよび外にピペットします。この溶液中のセクションを15分間インキュベートします。次に、1%過酸化水素の10マイクロリットルをDAB溶液に加えます。
細胞が標識されるまで、一定の撹拌下で暗闇の中で約1〜2分間反応を進行させます。ヒュームフードに、ペトリ皿にフィルターペーパーの小さな円を入れ、PBでそれを湿らします。ペイントブラシを使用してガラスバイアルからセクションを1つずつ持ち上げ、慎重に紙の上に平らに置きます。濾紙の別の湿った円でセクションをカバーし、表面にそっとティッシュペーパーを触ることによって余分な緩衝液を除去する。
PBに1%のオスミウム四酸化を8、9滴塗布します。皿を覆い、少なくとも30分間煙のフードに保持しますが、1時間以下です。セクションのすすめ、取り付け、カバーが切れた後、アルコール溶液の50%、70%、95%、および100%の一連のアルコール溶液を脱水します。
脱水工程に続き、100%エタノールを含むガラスバイアルに約5分間シェーカーに切片を移します。アルコール溶液をプロピレンオキシドに交換し、5分間3回洗浄します。最後の洗浄に続いて、バイアルに約2ミリリットルのプロピレンオキシドを入れ、樹脂を1:1の比率で添加します。
樹脂が溶解していることを確認し、セクションを一定の撹拌下で30分間保ちます。30分後、木製スティックを使用してエポキシ樹脂を含むアルミニウムプランシェットに各セクションを配置し、一晩インキュベートします。翌日、約10分間、ホットプレートの上にプランシェットを置きます。
その後、木製の棒で各セクションをピックアップし、きれいなスライドの上に置きます。すべてのセクションがスライドに移された後、分割顕微鏡の下でスライドを見て、スライスの向きを確認し、セクションの上にカバースリップを置きます。オーブンで56°Cで48時間硬化します。
低倍率の目的を使用して、セル本体を含むホームセクションに焦点を当てます。次に、100x の目的を使用し、セル本体に焦点を当て、中央をクリックして参照点をマークします。目標を 100x で 3D でソーマをトレースするには、トレース タブからコンターを選択し、セル のボディ輪郭を選択します。
ジョイスティックを使用して、セル本体の一番上にフォーカスを移動します。現在フォーカスしているパーツの周りをクリックしてポイントを配置します。右クリックして、この最初のアウトラインを終了するには、閉じる輪郭を選択します。
セル本体の下部に到達するまで、異なる z 位置でこのプロセスを繰り返します。樹状樹状のアーバーを追跡するには、ニューロンメニューで樹状突起または有端樹状突起を選択します。まず、マウススクロールホイールを使用して各樹状突起の短い初期セグメントをトレースし、ペンドライトの直径に合わせてカーソルの直径を調整します。
各樹状突起に沿ってトレースします。ツリー内のノードに到達したら、右クリックして、ドロップダウンメニューからノードの二股または三股ノードを選択します。完了したセクションと一致するセクション内の樹状突起間の一致する点を識別するには、[移動]タブをクリックしてマッチポイントを選択します。
一致する必要があるポイントの数を選択し、[OK]を押します。完成した分岐の終了をクリックし、ブランチをクリックします。各マッチ ポイントに対してこの手順を繰り返します。各セクションのすべての樹状突起が追跡されたら、ここに示されている同じプロセスを使用して軸索をトレースすることは、描画管を使用して樹状および軸索の樹状突起を有するCA2バスケットセルの再構成である。
樹状突起は黒で、軸索は赤です。これは、ここで説明するアビジンHRPプロトコルに従うビオシチン充填バスケット細胞の例画像である。ここに示されているのは、CA2バスケット細胞の3Dニューロン再構成のビデオです。
デンドライトは濃いピンク色で、軸索は白です。最後に、この画像はCA2バスケットセルの樹型図を示しています。このプロトコルに習熟する時間が必要です。
しかし、この最適化されたアプローチは、体外の複雑な皮質および海馬構造の高解像度画像を生成することができます。
