שיטה זו יכולה לעזור לסווג תת-סוגים עצביים ולהרחיב את הבנתנו את המפה הפונקציונלית של מעגלים קליפת המוח. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה כדי לשמר את המבנה האולטרה-מבנה של הנוירונים ולקבל התאוששות מצוינת של ארברים דנדריטיים ואקסונאליים, המאפשר שחזורים באיכות גבוהה. בסוף הקלטה אלקטרופיזיולוגית, להעביר את הפרוסה המכילה את התא המוקלט לצלחת קטנה של ACSF.
תוך כדי עבודה במכסה המנוע של האדים, מרדדים את הפרוסה על פיסת נייר מסנן קטנה ואיכותית ומ מניחים עוד פיסת נייר מסנן לחה על הפרוסה. מניחים את הרקמה בסיר פלסטיק קטן המכיל 5 עד 10 מיליליטר של פתרון קיבוע ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת, להעביר את הרקמה מן המיכל עם פתרון תיקון למיכל עם שני מיליליטר של חיץ פוספט טוחן 0.1 על מנת לשטוף, לחתוך כל רקמה עודפת עם להב אזמל.
הסר רקמה עודפת על ידי הנחת הפרוסה בצלחת פטרי, וחתך את הרקמה העודפת עם להב אזמל. מעבירים את הרקמה הקצוצה לצלחת פטרי נקייה, ומבטיחים שהיא שוכנת שטוחה ללא קפלים או קמטים. הסר את המאגר העודף באמצעות מברשת צבע יבשה.
מכסים את הרקמה בתסנת ג'לטין חמה ומ מניחים את צלחת פטרי על בלוק קפוא כדי לקרר במהירות את הפתרון. לאחר מכן, להעביר את המנה של הגדרת ג'לטין ל 4 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 60 דקות. במכסה המנוע של האדים, השתמש בלהב אזמל כדי לחתוך בלוק קטן באורך 1 X 1 ס"מ המכיל את הרקמה המוטבעת של הג'לטין.
הרם את הבלוק באמצעות מרית קטנה והעבר בזהירות לפתרון קיבוע טרי. אפשר לתקן לפחות 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר קיבעון שני זה, לשטוף את בלוק ג'לטין בחמישה מיליליטר של PB שלוש פעמים.
לאחר הכביסה, ייבשו את הבלוק בעזרת פיסת רקמת נייר. לאחר מכן השתמש בכמות קטנה של דבק cyanoacrylate כדי לתקוע את הבלוק, בכיוון עם הרקמה בחלק העליון, על משאית רטט באמצעות דבק סופר. חותכים את הפרוסה בעובי 50 מיקרון באמצעות רטט וממקמים כל קטע בזהירות בבקבוקון זכוכית המכיל 10 אחוז סוכרוז.
לאחר ההידור, אוספים בזהירות קטע מהבקבוקון ומ מניחים אותו שטוח במכסה צלחת פטרי. לאחר מכן השתמש בלהב אזמל טרי כדי להסיר את הג'לטין מסביב לקטע. מניחים את החלקים לתוך בקבוקון המכיל 2 מיליליטר של סוכרוז טרי 10 אחוז PB, ומתסיסים במשך 10 דקות כדי להתחיל את תהליך cryoprotection.
לאחר cryoprotection, מניחים את החלקים שטוחים על מלבן קטן של רדיד אלומיניום באמצעות מברשת צבע. מוציאים כל נוזל עודף מהסעיפים ומקפלים בזהירות את נייר הכסף לחבילה. החזק את רדיד האלומיניום קרוב לפני השטח של חנקן נוזלי מבלי לגעת בפני השטח במשך 30 שניות.
ואז לאפשר את החלקים להפשיר לחלוטין במשך כ 30 שניות. חזור על ההפשרה ההקפאה עוד פעמיים. הסר את כל החלקים מנייר כסף עם מברשת צבע והצב אותם לתוך בקבוקון זכוכית המכיל שני מיליליטר של PB לשטוף סוכרוז עודף תחת תסיסה מתמדת.
לאחר כשל חיסוני להדמיית פלואורסצנטיות, מניחים את הגלישה בצלחת פטרי מזכוכית המכילה PBS, ומסירים בזהירות את החלקת המכסה. לאחר מכן לשטוף את החלקים את השקופית באמצעות פולסים עדינים של PBS מתוך פיפטה פסטר. מניחים את החלקים לתוך בקבוקון זכוכית נקי המכיל PBS.
בצע את תגובת Avidin HRP על ידי הדגירה הראשונה של החלקים במתחם ביוטין אבידין או ABC, לפחות שעתיים כדי להגביר את מוצר תגובת HRP. לאחר מכן, לשטוף את החלקים עם PBS 3 פעמים במשך 10 דקות, ולאחר מכן עם חיץ טריס פעמיים במשך 10 דקות. לאחר הסרת לשטוף חיץ tris האחרון, להוסיף במהירות טיפה אחת של פתרון כלוריד ניקל שמונה אחוזים תותב diaminobenzidine או פתרון DAB.
לאחר מכן pipette הפתרון פנימה החוצה לערבב במהירות להוסיף מיליליטר אחד של פתרון זה על הסעיפים. הדגירה את החלקים בפתרון זה במשך 15 דקות. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של 1 אחוז מי חמצן לפתרון DAB.
אפשר לתגובה להמשיך בחושך תחת תסיסה מתמדת במשך כ 1 עד 2 דקות עד התאים מסומנים. במכסה המנוע של האדים, מניחים עיגול קטן של נייר סינון לתוך צלחת פטרי ומדכאים אותה עם PB. הרם את החלקים בזה אחר זה מבקבוקון הזכוכית באמצעות מברשת צבע והצב אותם בזהירות שטוחים על הנייר. מכסים את החלקים בעיגול לח אחר של נייר סינון ומסירים חיץ עודף על ידי נגיעה עדין בנייר טישו אל פני השטח.
החל שמונה או תשע טיפות של אחוז אחד osmium tetroxide ב PB על הנייר העליון. מכסים את המנה ושומרים על מכסה המנוע של האדים לפחות 30 דקות, אך לא יותר משעה. לאחר שטיפה, הרכבה, מכסה את החלקים, להתייבש באמצעות סדרה של 50 אחוז, 70 אחוז, 95 אחוז, ו 100 אחוז אלכוהול פתרונות.
לאחר שלב ההתייבשות, מעבירים את החלקים לבקבוקון זכוכית המכיל 100 אחוז אתנול על שייקר במשך כחמש דקות. החלף את תסנון האלכוהול בתחמוצת פרופילן ושטף שלוש פעמים במשך חמש דקות. לאחר הכביסה האחרונה, לשמור על סביב שני מיליליטר של תחמוצת פרופילן בבקבוקון ולהוסיף שרף ביחס 1:1.
ודא כי שהרשת מומסת ולשמור את החלקים תחת תסיסה מתמדת במשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, יש להשתמש במקל עץ כדי למקם כל קטע במטזי אלומיניום המכילים שרף אפוקסי, ולטרוב בן לילה. למחרת, מניחים את planchette על צלחת חמה במשך כ 10 דקות.
ואז להרים כל קטע עם מקל עץ ולמקום על שקופית נקייה. לאחר שכל המקטעים הועברו לשקופית, הצג את השקופית תחת מיקרוסקופ חותך כדי לבדוק את כיוון הפרוסות והצב כיסוי מעל המקטעים. מרפאים בתנור במשך 48 שעות ב-56 מעלות.
השתמש במטרה הגדלה נמוכה כדי להתמקד בסעיף הבית המכיל את גוף התא. לאחר מכן השתמש במטרה 100x, התמקד בגוף התא ולחץ במרכז כדי לסמן את נקודת ההתייחסות. למעקב אחר ה-soma ב-3D באמצעות המטרה 100x, בחרו מיתאר מהלשונית 'מעקב' ובחרו בקווי המתאר של גוף התא.
השתמש ג'ויסטיק כדי להעביר את המוקד לראש החלק העליון של גוף התא. מקם את הנקודות על-ידי לחיצה מסביב להיקף החלק שנמצא כעת במוקד. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר קו מתאר סגור כדי לסיים חלוקה לרמות ראשונה זו.
חזור על תהליך זה במיקומים z שונים עד שהתחתית של גוף התא הוא הגיע. כדי לעקוב אחר האילנות הדנידריטית, בחר דנדריט או דנדריט אפי, בתפריט הנוירון. ראשית, עקוב אחר מקטע התחלתי קצר עבור כל דנדריט באמצעות גלגל הגלילה של העכבר כדי להתאים את קוטר הסמן כך שיתאימו לקוטר הנדריט.
עקוב אחר כל דנדריט. כאשר מגיעים לצומת בעץ, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר צומת דו-קוטבי או צומת משולש מהתפריט הנפתח. כדי לזהות נקודות תואמות בין הנדריטים במקטע התואם למקטע שהושלם, לחץ על הכרטיסיה הזז ובחר נקודות התאמה.
בחר את מספר הנקודות שיש להתאים ולאחר מכן לחץ על אישור. לחץ על סיום ענף שהושלם ולאחר מכן לחץ על הענף. חזור על פעולה זו עבור כל נקודת משחק. לאחר כל dendrites של כל קטע כבר נעוצים, לעקוב אחר האקסון באמצעות אותו תהליך מוצג כאן הוא שחזור של תא סל CA2 עם ארבור דנדריטי ואקסונאלי מוגבל באמצעות צינור ציור.
הדנדריטים בשחור והאקסון באדום. זוהי תמונה לדוגמה של תא הסל מלא ביוציטין בעקבות פרוטוקול HRP אבידין המתואר כאן. מוצג כאן הוא וידאו של שחזור עצבי 3D של תא הסל CA2.
דנדריטים בוורוד כהה והאקסון בלבן. לבסוף, תמונה זו מציגה דנדרוגרמה של תא הסל CA2. זה ייקח זמן להיות מיומן עם פרוטוקול זה.
עם זאת, גישה ממוטבת זו יכולה ליצור תמונות ברזולוציה גבוהה של מבנים קליפת המוח והיפוקמפוס מורכבים במבחנה.
