Este método puede ayudar a clasificar los subtipos neuronales y ampliar nuestra comprensión del mapa funcional de los circuitos corticales. Este protocolo ha sido optimizado para preservar la ultraestructura de las neuronas y obtener una excelente recuperación de los árboles dendríticos y axonales, permitiendo reconstrucciones de alta calidad. Al final de un registro electrofisiológico, transfiera la rebanada que contiene la célula grabada a un pequeño plato de ACSF.
Mientras trabaja en una campana de humo, enrolle la rebanada sobre un pequeño pedazo de papel de filtro de alta calidad y coloque otra pieza de papel de filtro humedecido sobre la rebanada. Coloque el tejido en una olla de plástico pequeña que contenga de 5 a 10 mililitros de solución fijadora y guárdelo a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, transfiera el tejido del recipiente con solución fijadora a un recipiente con dos mililitros de tampón de fosfato molar 0,1 para enjuagar y cortar cualquier exceso de tejido con una cuchilla de bisturí.
Retire el exceso de tejido colocando la rebanada en un plato de Petri, y corte el exceso de tejido con una cuchilla de bisturí. Transfiera el tejido recortado a un plato limpio de Petri, asegurándose de que quede plano sin pliegues ni pliegues. Retire el sobrante con un pincel seco.
Cubra el tejido con una solución de gelatina tibia y coloque el plato Petri en un bloque congelado para enfriar rápidamente la solución. Luego, mueva el plato de la gelatina a 4 grados Celsius durante 30 a 60 minutos. En una campana de humo, usa una cuchilla de bisturí para cortar un pequeño bloque de 1 X 1 centímetro que contenga el tejido incrustado de gelatina.
Levante el bloque con una pequeña espátula y transfiera cuidadosamente a una solución fijadora fresca. Dejar reparar durante al menos 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de esta segunda fijación, lave el bloque de gelatina en cinco mililitros de PB tres veces.
Después del lavado, seque el bloque con un pedazo de papel. A continuación, utilice una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato para pegar el bloque, orientado con el tejido en la parte superior, en un camión vibratome usando súper pegamento. Secise la rodaja con un grosor de 50 micras con un vibratome y coloque cada sección cuidadosamente en un vial de vidrio que contenga una sacarosa del 10 por ciento.
Después de la sección, recoja cuidadosamente una sección del vial y colóquela plana en una tapa de la placa Petri. Luego usa una cuchilla de bisturí fresco para eliminar la gelatina alrededor de la sección. Coloque las secciones en un vial que contenga 2 mililitros de sacarosa fresca del 10 por ciento en PB, y agite durante 10 minutos para comenzar el proceso de crioprotección.
Después de la crioprotección, coloque las secciones planas sobre un pequeño rectángulo de papel de aluminio usando un pincel. Retire el exceso de líquido de las secciones y doble cuidadosamente la lámina en un paquete. Sujete la lámina de aluminio cerca de la superficie de nitrógeno líquido sin tocar la superficie durante 30 segundos.
Y luego permita que las secciones se descongelen por completo durante aproximadamente 30 segundos. Repita el deshielo congelado otras dos veces. Retire todas las secciones de la lámina con un pincel y colóquelas en un vial de vidrio que contenga dos mililitros de PB para lavar el exceso de sacarosa bajo agitación constante.
Después de la inmunosumanidad para la toma de imágenes por fluorescencia, coloque el portaobjetos en un plato de Petri de vidrio que contenga PBS y retire cuidadosamente el resbalón de la cubierta. A continuación, lave las secciones de la diapositiva con pulsos suaves de PBS de una pipeta Pasteur. Coloque las secciones en un vial de vidrio limpio que contenga PBS.
Realice la reacción de Avidin HRP incubando primero las secciones en el complejo de biotina de Avidin o ABC, durante al menos dos horas para amplificar el producto de reacción HRP. A continuación, lave las secciones con PBS 3 veces durante 10 minutos, y luego con tampón de tris dos veces durante 10 minutos. Después de eliminar el último lavado tampón tris, agregue rápidamente una gota de ocho por ciento de solución de cloruro de níquel a la solución de diaminobenzidina o solución DAB.
A continuación, pipetear la solución para mezclar y añadir rápidamente un mililitro de esta solución sobre las secciones. Incubar las secciones de esta solución durante 15 minutos. A continuación, agregue 10 microlitros de 1 por ciento de peróxido de hidrógeno a la solución DAB.
Permita que la reacción continúe en la oscuridad bajo agitación constante durante aproximadamente uno a dos minutos hasta que las células estén etiquetadas. En una campana de humo, coloque un pequeño círculo de papel de filtro en una placa de Petri y humedezca con PB. Levante las secciones de una en una del vial de vidrio con un cepillo de pintura y colóquelas cuidadosamente sobre el papel. Cubra las secciones con otro círculo humedecido de papel de filtro y retire el exceso de tampón tocando suavemente el papel tisú a la superficie.
Aplique ocho o nueve gotas de un porcentaje de tetróxido de osmio en PB en el papel superior. Cubra el plato y conserve en la campana de humo durante al menos 30 minutos, pero no más de 1 hora. Después de enjuagar, montar y cubrir las secciones, deshidratar a través de una serie de soluciones de alcohol al 50 por ciento, 70 por ciento, 95 por ciento y 100 por ciento.
Después de la etapa de deshidratación, transfiera las secciones a un vial de vidrio que contenga 100 por ciento de etanol en una coctelera durante aproximadamente cinco minutos. Sustituya la solución de alcohol por óxido de propileno y lávela tres veces durante cinco minutos. Después del último lavado, conservar alrededor de dos mililitros de óxido de propileno en el vial y añadir resina en una proporción de 1:1.
Asegúrese de que la resina esté disuelta y mantenga las secciones bajo agitación constante durante 30 minutos. Después de 30 minutos, utilice un palo de madera para colocar cada sección en una planchetta de aluminio que contenga resina epoxi, e incubar durante la noche. Al día siguiente, coloque el planchette en una placa caliente durante aproximadamente 10 minutos.
A continuación, recoger cada sección con un palo de madera y colocar en un diapositiva limpia. Una vez que todas las secciones se han transferido a la diapositiva, vea la diapositiva bajo un microscopio diseccionado para comprobar la orientación de las rebanadas y coloque un cubreobjetos sobre las secciones. Curar en el horno durante 48 horas a 56 grados centígrados.
Utilice un objetivo de aumento bajo para centrarse en la sección de inicio que contiene el cuerpo celular. A continuación, utilice un objetivo de 100x, concéntrese en el cuerpo de la celda y haga clic en el centro para marcar el punto de referencia. Para trazar el soma en 3D utilizando el objetivo 100x, seleccione el contorno en la pestaña de seguimiento y seleccione el contorno del cuerpo de la celda.
Utilice el joystick para mover el foco a la parte superior del cuerpo de la célula. Coloque los puntos haciendo clic alrededor del perímetro de la pieza que está actualmente enfocada. Haga clic con el botón derecho del 111, haga clic con el botón derecho del 18 y seleccione Cerrar contorno para finalizar este primer contorno.
Repita este proceso en diferentes posiciones z hasta que se alcance la parte inferior del cuerpo celular. Para rastrear el árbol dendrítico, seleccione dendrita o dendrita apical, en el menú de neuronas. En primer lugar, trace un segmento inicial corto para cada dendrita utilizando la rueda de desplazamiento del ratón para ajustar el diámetro del cursor para que coincida con el diámetro de la dendrita.
Traza a lo largo de cada dendrita. Cuando se alcanza un nodo en el árbol, haga clic con el botón derecho y seleccione nodo bifurcado o nodo de trifurcating en el menú desplegable. Para identificar puntos coincidentes entre las dendritas de una sección que coincidan como la sección completada, haga clic en la pestaña de movimiento y seleccione puntos de coincidencia.
Seleccione el número de puntos que debe coincidir y, a continuación, pulse OK. Haga clic en el final de una rama completada y, a continuación, haga clic en la rama. Repita esto para cada punto de coincidencia. Una vez que se han trazado todas las dendritas de cada sección, trazar el axón utilizando el mismo proceso que se muestra aquí es una reconstrucción de una célula de cesta CA2 con dendrítico restringido y arbónón axonal utilizando un tubo de dibujo.
Las dendritas están en negro y el axón está en rojo. Esta es una imagen de ejemplo de la celda de la cesta llena de biociatina siguiendo el protocolo Avidin HRP descrito aquí. Aquí se muestra un vídeo de una reconstrucción neuronal 3D de la célula de la cesta CA2.
Las dendritas son de color rosa oscuro y el axón es de color blanco. Por último, esta imagen muestra un dendrograma de la celda de la cesta CA2. Tomará tiempo ser competente con este protocolo.
Sin embargo, este enfoque optimizado puede generar imágenes de alta resolución de estructuras corticales y de hipocampo complejas in vitro.
