Biocytin Erholung und 3D-Rekonstruktionen der gefüllten Hippocampal CA2 Interneuronen

Diese Methode kann helfen, neuronale Subtypen zu klassifizieren und unser Verständnis der funktionellen Karte kortikaler Schaltkreise zu erweitern. Dieses Protokoll wurde optimiert, um die Ultrastruktur der Neuronen zu erhalten und eine ausgezeichnete Erholung sowohl derdritischer als auch axonaler Lauben zu erhalten, was qualitativ hochwertige Rekonstruktionen ermöglicht. Übertragen Sie am Ende einer elektrophysiologischen Aufzeichnung die Scheibe mit der aufgezeichneten Zelle auf eine kleine Schale VON ACSF.

Während der Arbeit in einer Dunstabzugshaube, rollen Sie die Scheibe auf ein kleines Stück fein hochwertiges Filterpapier und legen Sie ein weiteres Stück befeuchtetes Filterpapier auf die Scheibe. Das Gewebe in einen kleinen Plastiktopf mit 5 bis 10 Milliliter fixierender Lösung legen und über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Am nächsten Tag das Gewebe aus dem Behälter mit fixativer Lösung in einen Behälter mit zwei Millilitern 0,1 Molphosphatpuffer übertragen, um zu spülen, und schneiden Sie überschüssiges Gewebe mit einer Skalpellklinge ab.

Entfernen Sie überschüssiges Gewebe, indem Sie die Scheibe in eine Petrischale legen, und schneiden Sie das überschüssige Gewebe mit einer Skalpellklinge ab. Übertragen Sie das getrimmte Gewebe auf eine saubere Petrischale, um sicherzustellen, dass es flach ohne Falten oder Falten liegt. Entfernen Sie den überschüssigen Puffer mit einem trockenen Pinsel.

Bedecken Sie das Gewebe mit warmer Gelatinelösung und legen Sie die Petrischale auf einen gefrorenen Block, um die Lösung schnell abzukühlen. Dann bewegen Sie das Gericht der Einstellung Gelatine auf 4 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten. In einer Dunstabzugshaube schneiden Sie mit einer Skalpellklinge einen kleinen, 1 x 1 Zentimeter großen Block mit dem eingebetteten Gelatinegewebe aus.

Heben Sie den Block mit einem kleinen Spachtel an und übertragen Sie ihn vorsichtig in eine frische Fixierlösung. Mindestens 30 Minuten bei vier Grad Celsius fixieren. Nach dieser zweiten Fixierung den Gelatineblock dreimal in fünf Milliliter PB waschen.

Trocknen Sie den Block nach dem Waschen mit einem Stück Papiergewebe. Dann verwenden Sie eine kleine Menge Cyanoacrylat-Kleber, um den Block zu kleben, mit dem Gewebe an der Spitze ausgerichtet, auf einen Vibram-LKW mit Superkleber. Schneiden Sie die Scheibe mit einer Dicke von 50 Mikrometern mit einem Vibratom ab und legen Sie jeden Abschnitt sorgfältig in eine Glasdurchstechflasche mit 10 Prozent Saccharose.

Nach dem Schnitt einen Abschnitt vorsichtig von der Durchstechflasche aufnehmen und flach in einen Petrischalendeckel legen. Verwenden Sie dann eine frische Skalpellklinge, um die Gelatine um den Abschnitt herum zu entfernen. Legen Sie die Abschnitte in eine Durchstechflasche mit 2 Milliliter frische 10 Prozent Saccharose in PB, und agitieren Sie für 10 Minuten, um den Kryoschutzprozess zu beginnen.

Legen Sie die Abschnitte nach kryoschutzweise mit einem Pinsel flach auf ein kleines Rechteck aus Aluminiumfolie. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Abschnitten und falten Sie die Folie vorsichtig in ein Paket. Halten Sie die Aluminiumfolie in der Nähe der Oberfläche von flüssigem Stickstoff, ohne die Oberfläche für 30 Sekunden zu berühren.

Und dann lassen Sie die Abschnitte für etwa 30 Sekunden vollständig auftauen. Wiederholen Sie das Einfrieren Tauwetter noch zwei Mal. Entfernen Sie alle Abschnitte von der Folie mit einem Pinsel und legen Sie sie in eine Glasflasche mit zwei Milliliter PB, um überschüssige Saccharose unter ständiger Erregung abzuwaschen.

Nach der Immunfärbung für fluoreszenzbildende Bildgebung, legen Sie das Dia in eine Glas Petrischale mit PBS enthalten, und entfernen Sie vorsichtig den Deckelschlupf. Dann waschen Sie die Abschnitte von der Rutsche mit sanften Impulsen von PBS aus einer Pasteur Pipette. Legen Sie die Abschnitte in eine saubere Glasdurchstechflasche mit PBS.

Führen Sie die Avidin HRP-Reaktion durch erste Inkubation der Abschnitte in Avidin Biotin-Komplex oder ABC, für mindestens zwei Stunden, um das HRP-Reaktionsprodukt zu verstärken. Als nächstes waschen Sie die Abschnitte mit PBS 3 mal für 10 Minuten, und dann mit Tris Puffer zweimal für 10 Minuten. Nach dem Entfernen der letzten Tris Pufferwäsche, fügen Sie schnell einen Tropfen von acht Prozent Nickelchlorid-Lösung auf die Diaminobenzidin-Lösung oder DAB-Lösung.

Dann Pipette die Lösung in und aus zu mischen und schnell einen Milliliter dieser Lösung über die Abschnitte hinzufügen. Inkubieren Sie die Abschnitte in dieser Lösung für 15 Minuten. Dann fügen Sie 10 Mikroliter 1 Prozent Wasserstoffperoxid in die DAB-Lösung.

Lassen Sie die Reaktion im Dunkeln unter ständiger Agitation für etwa ein bis zwei Minuten ablaufen, bis die Zellen beschriftet sind. In einer Dunstabzugshaube einen kleinen Kreis Filterpapier in eine Petrischale legen und mit PB dämpfen. Heben Sie die Abschnitte nacheinander mit einem Pinsel aus der Glasflasche und legen Sie sie vorsichtig flach auf das Papier. Bedecken Sie die Abschnitte mit einem weiteren befeuchteten Kreis von Filterpapier und entfernen Sie überschüssigen Puffer, indem Sie Gewebepapier sanft an die Oberfläche berühren.

Acht oder neun Tropfen von einem Prozent Osmiumtetroxid in PB auf das oberste Papier auftragen. Bedecken Sie das Gericht und behalten Sie in der Dunstabzugshaube für mindestens 30 Minuten, aber nicht mehr als 1 Stunde. Nach dem Spülen, Montieren und Abdecken der Abschnitte, dehydrieren Sie durch eine Reihe von 50 Prozent, 70 Prozent, 95 Prozent und 100 Prozent Alkohollösungen.

Nach dem Austrocknungsschritt die Abschnitte für etwa fünf Minuten in eine Glasdurchstechflasche mit 100 Prozent Ethanol auf einem Shaker übertragen. Ersetzen Sie die Alkohollösung durch Propylenoxid und waschen Sie sie dreimal für fünf Minuten. Nach der letzten Wäsche etwa zwei Milliliter Propylenoxid in der Durchstechflasche aufbewahren und Harz im Verhältnis 1:1 hinzufügen.

Stellen Sie sicher, dass das Harz gelöst ist und halten Sie die Abschnitte 30 Minuten lang unter ständiger Rührung. Nach 30 Minuten verwenden Sie einen Holzstab, um jeden Abschnitt in eine Aluminiumplanchette mit Epoxidharz zu legen, und über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag die Planchette für ca. 10 Minuten auf eine Kochplatte stellen.

Dann nehmen Sie jeden Abschnitt mit einem Holzstab und legen Sie auf einer sauberen Rutsche. Nachdem alle Abschnitte auf die Folie übertragen wurden, sehen Sie sich die Folie unter einem Seziermikroskop an, um die Ausrichtung der Scheiben zu überprüfen und einen Deckelschlupf über die Abschnitte zu legen. 48 Stunden im Ofen bei 56 Grad Celsius aushärten.

Verwenden Sie ein Ziel mit niedriger Vergrößerung, um sich auf den Home-Abschnitt zu konzentrieren, der den Zellkörper enthält. Verwenden Sie dann ein 100-faches Ziel, konzentrieren Sie sich auf den Zellkörper, und klicken Sie in die Mitte, um den Referenzpunkt zu markieren. Um das Soma in 3D mit dem 100x-Objektiv zu verfolgen, wählen Sie Kontur aus der Spurenregisterkarte aus, und wählen Sie die Zellkörperkontur aus.

Verwenden Sie den Joystick, um den Fokus ganz oben auf den Zellkörper zu verschieben. Platzieren Sie die Punkte, indem Sie auf den Umfang des Teils klicken, das sich derzeit im Fokus befindet. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie die Kontur schließen aus, um diese erste Gliederung abzuschließen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang an verschiedenen Z-Positionen, bis der Boden des Zellkörpers erreicht ist. Um die dendritische Laube zu verfolgen, wählen Sie Dendrit oder apikal dendrit, im Neuronenmenü. Verfolgen Sie zunächst ein kurzes Anfangssegment für jeden Dendriten mit dem Mausscrollrad, um den Durchmesser des Cursors an den Durchmesser des Dendriten anzupassen.

Verfolgen Sie entlang jedes Dendriten. Wenn ein Knoten in der Struktur erreicht ist, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Bifurcating-Knoten oder den Trifurcating-Knoten aus dem Dropdown-Menü. Um übereinstimmende Punkte zwischen den Dendriten in einem Abschnitt zu identifizieren, der als abgeschlossener Abschnitt übereinstimmt, klicken Sie auf die Registerkarte Verschieben, und wählen Sie Übereinstimmungspunkte aus.

Wählen Sie die Anzahl der Punkte aus, die abgeglichen werden müssen, und drücken Sie dann OK. Klicken Sie auf das Ende einer abgeschlossenen Filiale und dann auf die Filiale. Wiederholen Sie dies für jeden Matchpunkt. Sobald alle Dendriten jedes Abschnitts zurückverfolgt wurden, verfolgen Sie das Axon mit dem gleichen Verfahren, das hier gezeigt wird, eine Rekonstruktion einer CA2-Korbzelle mit eingeschränkter dendritischer und axonaler Laube mit einem Zeichenrohr.

Die Dendriten sind in schwarz und das Axon ist in rot. Dies ist ein Beispielbild der biocytingefüllten Korbzelle nach dem hier beschriebenen Avidin HRP-Protokoll. Hier ist ein Video einer neuronalen 3D-Rekonstruktion der CA2-Korbzelle zu sehen.

Dendriten sind in dunkelrosa und das Axon in weiß. Schließlich zeigt dieses Bild ein Dendrogramm der CA2-Korbzelle. Es wird einige Zeit dauern, bis dieses Protokoll kompetent wird.

Dieser optimierte Ansatz kann jedoch hochauflösende Bilder komplexer kortikaler und hippocampaler Strukturen in-vitro erzeugen.