Bu yöntem nöronal alt tipleri sınıflandırmaya yardımcı olabilir ve kortikal devrelerin fonksiyonel haritası anlayışımızı genişletmek. Bu protokol, nöronların ultrayapısını korumak ve hem dendritik hem de aksonal çardakların mükemmel bir şekilde geri kazanımını elde etmek için optimize edilmiştir ve yüksek kaliteli rekonstrüksiyonlara olanak sağlar. Elektrofizyolojik kaydın sonunda, kaydedilen hücreyi içeren dilimi küçük bir ACSF kabına aktarın.
Duman kaputunda çalışırken, dilimi ince kalitede filtre kağıdının küçük bir parçasının üzerine yuvarlayın ve dilimin üzerine başka bir nemlendirilmiş filtre kağıdı yerleştirin. Dokuyu 5 ila 10 mililitre fiksatif çözelti içeren küçük bir plastik tencereye yerleştirin ve bir gecede dört santigrat derecede saklayın. Ertesi gün, durulamak için 0.1 molar fosfat tampon iki mililitre ile bir kap için fiksatif çözelti ile konteyner doku aktarın ve bir neşter bıçak ile herhangi bir fazla doku kesip.
Bir Petri kabına dilim yerleştirerek fazla doku çıkarın ve bir neşter bıçak ile aşırı doku kesip. Kesilmiş dokuyu temiz bir Petri kabına aktarın ve kıvrımveya kırışıklık olmadan düz olmasını sağlar. Kuru boya fırçası kullanarak fazla arabelleği çıkarın.
Sıcak jelatin çözeltisi ile doku kapağı ve hızlı bir şekilde çözelti soğutmak için dondurulmuş bir blok üzerine Petri çanak yerleştirin. Daha sonra jelatina ayar yemeğini 30-60 dakika boyunca 4 dereceye taşıyın. Bir duman kaputunda, jelatin gömülü doku içeren küçük, 1 X 1 santimetrelik bir blok kesmek için bir neşter bıçak kullanın.
Küçük bir spatula kullanarak bloğu kaldırın ve taze fiksatif çözeltiye dikkatlice aktarın. Dört santigrat derecede en az 30 dakika düzeltmek için izin verin. Bu ikinci fiksasyondan sonra jelatin bloğunu beş mililitre PB'de üç kez yıkayın.
Yıkadıktan sonra, bir kağıt mendil parçası kullanarak blok kuru. Sonra süper tutkal kullanarak bir vibratome kamyon üzerine, üst doku ile yönelik blok sopa için siyanoakrilat tutkal küçük bir miktar kullanın. Bir vibratom kullanarak 50 mikron kalınlığında dilim bölüm ve yüzde 10 sakaroz içeren bir cam şişe dikkatlice her bölümü yerleştirin.
Kesitsonra, dikkatlice şişeden bir bölüm almak ve bir Petri çanak kapağı içine düz yerleştirin. Sonra bölümün çevresindejelatin kaldırmak için taze bir neşter bıçak kullanın. PB taze yüzde 10 sakaroz 2 mililitre içeren bir şişe içine bölümleri yerleştirin ve kriyokoruma işlemine başlamak için 10 dakika boyunca çalkalayın.
Kriyokorumayı takiben, bölümleri boya fırçası kullanarak küçük bir alüminyum folyo dikdörtgeninüzerine düz bir şekilde yerleştirin. Bölümlerden herhangi bir fazla sıvı çıkarın ve dikkatle bir paket içine folyo katlayın. Alüminyum folyoyu 30 saniye boyunca yüzeye dokunmadan sıvı nitrojen yüzeyine yakın tutun.
Ve sonra bölümlerin yaklaşık 30 saniye boyunca tamamen erimesine izin verin. Dondurma yı tekrarlayın, iki kez daha çözülün. Bir fırça ile folyo tüm bölümleri çıkarın ve sürekli ajitasyon altında aşırı sakaroz yıkamak için PB iki mililitre içeren bir cam şişe içine yerleştirin.
Floresan görüntüleme için immünboyama sonra, PBS içeren bir cam Petri kabıiçine slayt yerleştirin ve dikkatlice kapak kayma kaldırın. Daha sonra pasteur pipetinden pbs'nin yumuşak darbelerini kullanarak slayttaki bölümleri yıkayın. Bölümleri PBS içeren temiz bir cam şişeye yerleştirin.
HrP reaksiyon ürünyükseltmek için en az iki saat, Avidin biotin kompleksi veya ABC bölümleri kuluçka ile Avidin HRP reaksiyonu gerçekleştirin. Daha sonra, 10 dakika pbs ile 3 kez bölümleri yıkayın ve sonra 10 dakika boyunca iki kez tris tampon ile. Son tris tampon yıkama çıkardıktan sonra, hızlı diaminobenzidin çözeltisi veya DAB çözeltisi için yüzde sekiz nikel klorür çözeltisi bir damla ekleyin.
Daha sonra çözeltiyi karıştırıp karıştırın ve bu çözeltinin bir mililitresini bölümlerin üzerine hızla ekleyin. Bu çözeltideki bölümleri 15 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra DAB çözeltisine yüzde 1 hidrojen peroksit 10 mikrolitre ekleyin.
Hücreler etiketlenene kadar reaksiyonun karanlıkta sürekli ajitasyon altında yaklaşık bir ila iki dakika devam etmesine izin verin. Bir duman başlık içinde, bir Petri kabına filtre kağıt küçük bir daire yerleştirin ve PB ile nemle. Bir boya fırçası kullanarak cam şişeden bölümleri birer birer kaldırın ve dikkatlice kağıt üzerinde düz yerleştirin. Bölümleri başka bir nemlendirilmiş filtre kağıdı çemberi ile kapatın ve kağıt mendil kağıdını yüzeye hafifçe dokunarak fazla tamponu çıkarın.
Üst kağıda PB'deki %1 osmiyum tetroksitin sekiz veya dokuz damlasını uygulayın. Çanak kapak ve en az 30 dakika boyunca duman kaputunda tutmak, ama en fazla 1 saat. Durulama, montaj ve bölümleri kapladıktan sonra, yüzde 50, yüzde 70, yüzde 95 ve yüzde 100 alkol çözeltileri bir dizi ile dehydrate.
Dehidratasyon adımını takiben, bölümleri yaklaşık beş dakika boyunca bir çalkalayıcıüzerinde yüzde 100 etanol içeren cam bir şişeye aktarın. Propilen oksit ile alkol çözeltisi değiştirin ve beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, şişede propilen oksit yaklaşık iki mililitre tutun ve 1:1 oranında reçin ekleyin.
Resenin eridiğinden emin olun ve bölümleri 30 dakika boyunca sürekli ajitasyon altında tutun. 30 dakika sonra, epoksi reçine içeren alüminyum bir planchette her bölümü yerleştirmek için ahşap bir sopa kullanın, ve gece kuluçka. Ertesi gün, yaklaşık 10 dakika sıcak bir plaka üzerine planchette yerleştirin.
Sonra ahşap bir sopa ile her bölümü almak ve temiz bir slayt üzerinde yer. Tüm bölümler slayta aktarıldıktan sonra, dilimlerin yönünü kontrol etmek için slaytı bir kesme mikroskobu altında görüntüleyin ve bölümlerin üzerine bir kapak kayması yerleştirin. 56 santigrat derecede 48 saat fırında kür.
Hücre gövdesini içeren ev bölümüne odaklanmak için düşük büyütme hedefi kullanın. Sonra 100x hedefi kullanın, hücre gövdesine odaklanın ve başvuru noktasını işaretlemek için merkeze tıklayın. 100x hedefini kullanarak soma'yı 3B olarak izlemek için izleme sekmesinden kontur seçin ve hücre gövdesi konturunu seçin.
Odak hücre vücudunun en üstüne taşımak için joystick kullanın. Şu anda odaklanmış olan parçanın çevresini tıklatarak noktaları yerleştirin. Bu ilk anahattı bitirmek için sağ tıklatın ve yakın kontur seçin.
Hücre gövdesinin altına ulaşılınceye kadar bu işlemi farklı z pozisyonlarında tekrarlayın. Dendritik arbor izlemek için, nöron menüsünde, dendrit veya apikal dendrit seçin. İlk olarak, imlecin çapını denditin çapına uyacak şekilde ayarlamak için fare kaydırma tekerleğini kullanarak her dendrite için kısa bir başlangıç segmenti iz.
Her dendrite boyunca iz. Ağaçtaki bir düğüme ulaşıldığında, açılan menüden bifurcating düğümü veya trifurcating düğümü sağ tıklatın ve seçin. Tamamlanan bölümle eşleşen bir bölümdeki dendritler arasındaki eşleşen noktaları belirlemek için, hareket sekmesine tıklayın ve maç noktalarını seçin.
Eşleşmesi gereken puan sayısını seçin ve ardından Tamam'a basın. Tamamlanan bir dalışun sonuna tıklayın ve ardından dala tıklayın. Bunu her maç noktası için tekrarlayın. Her bölümün tüm dendritleri izlendikten sonra, burada gösterilen aynı işlemi kullanarak akson izini bir çizim tüpü kullanarak sınırlı dendritik ve aksonal arbor ile bir CA2 sepet hücre nin rekonstrüksiyonudur.
Dendritler siyah, akson kırmızı. Bu burada açıklanan Avidin HRP protokolü aşağıdaki biocytin dolu sepet hücre örnek bir görüntüdür. Burada gösterilen CA2 sepet hücresinin bir 3D nöronal rekonstrüksiyon bir video.
Dendritler koyu pembe, akson ise beyaz. Son olarak, bu resim CA2 sepet hücresinin bir dendrogramını gösterir. Bu protokolle yeterli olmak zaman alacaktır.
Ancak, bu optimize yaklaşım karmaşık kortikal ve hipokampal yapıların yüksek çözünürlüklü görüntüleri in-vitro oluşturabilirsiniz.
