이 방법은 신경 아류형을 분류하고 피질 회로의 기능지도에 대한 이해를 확장하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 뉴런의 초구조를 보존하고 수지상 및 축축식 식소의 우수한 회복을 얻기 위해 최적화되어 고품질의 재구성을 가능하게 합니다. 전기 생리학적 기록의 끝에서, ACSF의 작은 접시에 기록 된 세포를 포함하는 조각을 전송.
연기 후드에서 작업하는 동안, 좋은 품질의 필터 용지의 작은 조각에 슬라이스를 롤과 조각에 촉촉한 필터 종이의 또 다른 조각을 배치합니다. 조직을 5~10밀리리터의 고정 용액이 들어 있는 작은 플라스틱 냄비에 놓고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 다음 날, 고정 용액을 가진 용기에서 0.1 개의 어금니 완충제 2 밀리리터가있는 용기로 조직을 옮기고 메스 블레이드로 과도한 조직을 잘라냅니다.
페트리 접시에 슬라이스를 배치하여 과잉 조직을 제거하고, 메스 블레이드와 여분의 조직을 잘라. 손질된 티슈를 깨끗한 페트리 접시에 전달하여 주름이나 주름없이 평평하게 놓이도록 합니다. 드라이 페인트 브러시를 사용하여 과도한 버퍼를 제거합니다.
따뜻한 젤라틴 용액으로 조직을 덮고 페트리 접시를 냉동 블록에 놓고 용액을 빠르게 식힙니다. 그런 다음 젤라틴을 섭씨 4도로 30~60분간 옮는다. 연기 후드에서 메스 블레이드를 사용하여 젤라틴 내장 조직을 포함하는 작은 1 X 1 센티미터 블록을 잘라냅니다.
작은 주걱을 사용하여 블록을 들어 올리고 신중하게 신선한 고정 솔루션으로 전송합니다. 섭씨 4도에서 30분 이상 수정할 수 있습니다. 이 두 번째 고정에 따라 젤라틴 블록을 PB의 5 밀리리터로 세 번 세척하십시오.
세척 후 종이 조직을 사용하여 블록을 건조시십시오. 그런 다음 소량의 시아노아크라일트 접착제를 사용하여 상단에 있는 조직을 중심으로 한 블록을 슈퍼 접착제를 사용하여 진동트럭에 고정시합니다. 진동을 사용하여 50 미크론 두께로 슬라이스를 섹션과 10 %의 자당을 포함하는 유리 유리 바이알에 각 섹션을 신중하게 배치합니다.
단면 후, 조심스럽게 바이알에서 섹션을 선택하고 페트리 접시 뚜껑에 평평하게 놓습니다. 그런 다음 신선한 메스 블레이드를 사용하여 섹션 주변에서 젤라틴을 제거합니다. 섹션은 PB에서 신선한 10 % 자당 2 밀리리터를 포함하는 바이알에 넣고 10 분 동안 교반하여 극저온 보호 프로세스를 시작합니다.
냉동 보호 후, 페인트 브러시를 사용하여 알루미늄 호일의 작은 사각형에 섹션을 평평하게 놓습니다. 섹션에서 여분의 액체를 제거하고 조심스럽게 소포에 호일을 접어. 알루미늄 호일을 30초 동안 표면에 닿지 않고 액체 질소 표면 가까이에서 잡습니다.
그런 다음 섹션이 약 30초 동안 완전히 해동되도록 합니다. 동결을 두 번 더 해동반복합니다. 페인트 브러시로 호일에서 모든 섹션을 제거하고 일정한 동요에서 과도한 자당을 씻어 PB의 두 밀리리터를 포함하는 유리 유리 바이알에 배치합니다.
형광 화상 진찰을 위해 면역 염색 한 후, PBS가 들어있는 유리 페트리 접시에 슬라이드를 넣고 조심스럽게 커버 슬립을 제거합니다. 그런 다음 파스퇴르 파이펫에서 PBS의 부드러운 펄스를 사용하여 슬라이드에서 섹션을 씻어 냅니다. 섹션을 PBS가 들어 있는 깨끗한 유리 바이알에 넣습니다.
아비딘 바이오틴 복합체 또는 ABC의 섹션을 먼저 배양하여 HRP 반응 생성물을 증폭시키기 위해 적어도 2시간 동안 아비딘 HRP 반응을 수행한다. 그런 다음 PBS로 섹션을 10 분 동안 3 번 씻은 다음 tris 버퍼로 10 분 동안 두 번 버퍼링합니다. 마지막 트라이버퍼 워시를 제거한 후, 디아미노벤지딘 용액 또는 DAB 용액에 8% 니켈 염화물 용액 1방울을 빠르게 추가합니다.
그런 다음 솔루션을 혼합하고 섹션에 이 솔루션의 밀리리터 1밀리리터를 빠르게 추가합니다. 이 솔루션의 섹션을 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 DAB 용액에 과산화수소 1%의 마이크로리터 10을 추가합니다.
세포가 표지될 때까지 약 1~2분 동안 일정한 동요 하에서 암흑에서 반응을 진행할 수 있도록 한다. 연기 후드에 작은 필터 용지 원을 페트리 접시에 넣고 PB로 감쇠합니다. 페인트 브러시를 사용하여 유리 유리 병에서 한 번에 하나씩 섹션을 들어 올리고 조심스럽게 종이에 평평하게 놓습니다. 필터 용지의 또 다른 촉촉한 원으로 섹션을 덮고 티슈 페이퍼를 표면에 부드럽게 터치하여 과도한 버퍼를 제거합니다.
상단 용지에 PB에 1% 오스뮴 테트옥사이드의 8~9방울을 적용합니다. 접시를 덮고 연기 후드에 적어도 30 분 동안 유지하지만 1 시간 이상 보관하십시오. 헹도, 장착 및 커버를 한 후, 50%, 70%, 95%, 알코올 100% 시리즈를 통해 탈수합니다.
탈수 단계에 따라, 약 5 분 동안 셰이커에 100 % 에탄올을 포함하는 유리 바이알로 섹션을 전송합니다. 알코올 용액을 프로필렌 옥사이드로 대체하고 5분 동안 세 번 씻습니다. 마지막 세척 에 이어, 유리병에 있는 프로필렌 산화물의 약 2 밀리리터를 유지하고 1:1 비율로 수지추가.
수지가 용해되었는지 확인하고 단면을 30분 동안 일정한 교반 아래에 유지합니다. 30분 후, 나무 막대기를 사용하여 각 섹션을 에폭시 수지가 들어 있는 알루미늄 플랑셰트에 놓고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 플랑셰트를 핫 플레이트에 약 10분간 놓습니다.
그런 다음 나무 막대기로 각 섹션을 선택하고 깨끗한 슬라이드에 놓습니다. 모든 섹션이 슬라이드로 옮겨지면 해부 현미경 아래에서 슬라이드를 보고 슬라이스의 방향을 확인하고 섹션 위에 덮개 슬립을 놓습니다. 오븐에서 섭씨 56도에서 48시간 동안 치료하십시오.
낮은 배율 목표를 사용하여 세포 체를 포함하는 홈 섹션에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 100x 목표를 사용하고 셀 본문에 초점을 맞추고 중앙을 클릭하여 기준점을 표시합니다. 100x 목표를 사용하여 3D로 소마를 추적하려면 추적 탭에서 윤곽을 선택하고 셀 본체 윤곽을 선택합니다.
조이스틱을 사용하여 포커스를 세포 몸의 맨 위로 이동합니다. 현재 초점이 맞춰진 부품의 둘레를 클릭하여 점을 배치합니다. 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 닫기 윤곽을 선택하여 이 첫 번째 윤곽선을 완료합니다.
셀 바디의 바닥에 도달할 때까지 다른 z 위치에서 이 과정을 반복합니다. 수지상 식목을 추적하려면 뉴런 메뉴에서 원점 또는 정점 원점을 선택합니다. 먼저 마우스 스크롤 휠을 사용하여 각 원원막에 대한 짧은 초기 세그먼트를 추적하여 커서의 직경을 조정하여 원더의 직경에 맞게 조정합니다.
각 수상월을 따라 추적합니다. 트리의 노드에 도달하면 드롭다운 메뉴에서 분기 노드 또는 트리퍼케이팅 노드를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 선택합니다. 완료된 섹션으로 일치하는 섹션의 원점 일치 점을 식별하려면 이동 탭을 클릭하고 일치 점을 선택합니다.
일치하는 데 필요한 포인트 수를 선택한 다음 확인을 누릅니다. 완성된 분기의 끝을 클릭한 다음 분기를 클릭합니다. 각 일치점에 대해 이 것을 반복합니다. 각 섹션의 모든 원더라이트가 추적되면, 여기에 표시된 동일한 프로세스를 사용하여 축축을 추적하면 드로잉 튜브를 사용하여 제한된 수지상 및 축산 아버가있는 CA2 바구니 셀의 재구성입니다.
수상자는 검은색으로, 축산은 빨간색입니다. 여기에 기재된 아비딘 HRP 프로토콜에 따른 바이오시틴 충전 바구니 세포의 예상이다. 여기에 표시된 CA2 바구니 세포의 3D 뉴런 재구성 의 비디오입니다.
펜드라이트는 짙은 분홍색으로, 축산은 흰색입니다. 마지막으로, 이 이미지는 CA2 바구니 셀의 덴드로그램을 보여줍니다. 이 프로토콜에 능숙해지는 데는 시간이 걸릴 것입니다.
그러나, 이 최적화된 접근은 체외에서 복잡한 피질 및 해마 구조물의 고해상도 심상을 생성할 수 있습니다.
