したがって、この方法は、特定の薬物が生物でどのように振る舞うかについての創薬プロセスの重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、大きなサンプルサイズを迅速かつ効率的にスクリーニングできることです。この技術は、薬物候補の効果の高度な定量的評価を可能にすることによって、すでに創薬に大きな影響を与えています。
この方法は、誤って折り畳む疾患の発症および進行に関する新しい機械主義的洞察を提供する。さらに、この方法は、老化や遺伝子スクリーニングなどの他のシステムにも適用することができる。私たちは、創薬の分野に新しい物理的方法を導入するこの機会に非常に興奮しています。
スクリーニングステップはこのノボ自動技術に高い知識を必要とするので、この方法のこれらの悪魔は重要である。手順を実証することは、私たちの研究室の検索アシスタントであるサム・キャスフォードです。処置を開始する前に、各薬物化合物の2.2ミリルタを、ワーム株当たり6つの5-フルオロデオキシウリジンまたはFUDRプレートに適切な濃度で添加し、プレート全体に慎重に化合物を広げ、滅菌条件下でプレートを乾燥させた。
プレートが乾燥している間、M9バッファーの15ミリリットルを使用して、5つの豊富な線虫成長因子プレートからワームを洗浄し、解放されたワームを遠心分離のための円錐形のチューブに移します。L4幼虫段階のワーム数を定量化するために、ネマトデスを3ミリリットルの新鮮なM9バッファーに再中断し、種700 L4幼虫をワーム株当たり6つの乾燥したFUDRプレートのそれぞれに、化合物ごとに再中断します。すべての線虫を播種したら、24時間摂氏24度で温度を上げて、パーリシスが誘発される株を含むプレートを置きます。
翌日、パラレルワームトラッカーのステージライトを点灯し、70パーセントのエタノールでトラッカーのガラスステージをきれいにします。目に見える残留物が残っていない場合は、レンズキャップを取り外し、エアダスターを使用してイメージングレンズを清掃します。カメラが正しく接続され、インストールされていることを確認し、画像キャプチャーソフトウェアで録画を開始します。
適切な Mono-16 記録パラメータを使用して、1 秒あたり 20 フレームを記録するようにカメラ設定を調整します。空の9センチのシャーレを使用して、ステージが正しい高さに設定されていることを確認し、必要に応じてステージを調整します。滅菌条件下では、M9溶液を運動性スクリーニングプレートに3ミリリットル加え、M9溶液2ミリリットルを使用して、同じ実験群から2つの線虫質を積んだFUDRプレートの表面積の1/3をスクリーニングプレートに洗浄します。
次に、スクリーニングプレートをトラッカーステージに配置します。カメラを集中させ、動物の記録を開始するために、単一のワームを使用します。録音が完了したら、運動プレートを捨て、FUDRプレートをインキュベーターに戻す前に一度使用されるようにマークします。
ビデオデータを分析するには、パラレルワームトラッカーデータ分析ソフトウェアグラフィックユーザーインターフェイスを開き、参照機能を使用して目的のビデオをロードします。出力先フォルダを選択し、30 秒の解析に 600 ~ 1200 フレームが設定されていることを確認します。フル解像度で9センチメートルのシャーレのイメージング用に0.029ピクセルからミリメートル変換係数を挿入し、死んだトラッキングを維持するアルゴリチムを選択します。
[位置指定パラメーター] タブで、Z-use イメージを 100、Z パディングを 3、標準ピクセルを 54、しきい値を 9、開口部を 1、終了を 2 に設定します。フィルタリングパラメータを最小サイズ20、最大サイズ180、0.94などのワームに調整します。形成軌道パラメータを最大距離移動数10、最小長150、メモリ10に設定します。
ベンドとベロシティパラメータを、ベンドしきい値しきい値 1.8、最小ベンド 0、フレームを設定して速度を 150 に見積もります。デッドワームの統計情報を、1 分あたり最大 5 回の最大速度、および最大速度 1 に調整します。出力フォルダーを選択し、出力フレーム数を 50 に、フォント・サイズを 10 に選択します。
このサンプル関数を使用して、パラメーターをテストし、サンプル・イメージを出力して、8 つのしきい値ステップを通じてワームが可視かどうかを確認します。次に「ジョブ開始」機能を開始し、データ・セット全体の個々の結果を結合してテスト結果ファイルを分析し、TSV関数へのエクスポートを介して結果を保存します。この方法により、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患の各種ワームモデルの大規模な集団研究に対する線虫型の特性評価が可能になります。
パーキンソン病およびアルツハイマー病のワームモデルを用いて、潜在的な治療分子の効果の特徴付けと同様に。これらの測定の高精度は、従来の方法と比較して分析できるワームの数を増やすことによって達成されます。この手順を実行する場合、虫の運動性への追加から追跡の開始までの時間を最小限に抑えることが重要です。
この手順に従って、結果を補足し、タンパク質凝集とリンクする他の方法を実行することができます。開発後、この技術は、パーキンソン病やアルツハイマー病などの神経変性疾患や誤折性疾患の分野の研究者が適切な発見アプリケーションを探求する道を開きました。FUDRを使用すると非常に危険な作業が可能であり、ニトリル手袋を着用するなどの予防措置は、この手順を実行する場合は常に行う必要があります。
