Assim, este método pode ajudar a responder perguntas-chave em um processo de descoberta de drogas sobre como uma droga específica se comporta em um organismo vivo. A principal vantagem desta técnica é que permite que grandes tamanhos de amostra sejam rastreados de forma rápida e eficiente. Esta técnica já está tendo um grande impacto na descoberta de drogas, permitindo uma avaliação altamente quanititativa dos efeitos dos candidatos a medicamentos.
Este método fornece novas percepções mecanicistas sobre o início e a progressão de doenças de dobras erradas. Além disso, esse método também pode ser aplicado a outros sistemas, como envelhecimento e triagens genéticas. Estamos muito animados com esta oportunidade de introduzir novos métodos físicos no espaço da descoberta de drogas.
Essas demonações deste método são críticas, pois as etapas de triagem requerem alta familiaridade com esta nova técnica automática. Demonstrando o procedimento estará Sam Casford, um assistente de busca do nosso laboratório. Antes de iniciar o procedimento, adicione 2,2 mililitros de cada composto de droga na concentração apropriada a seis placas de 5 fluorodeoxyuridina ou FUDR por cepa de verme, espalhando cuidadosamente o composto sobre toda a superfície da placa, e seque as placas em condições estéreis.
Enquanto as placas estão secando, use 15 mililitros de tampão M9 para lavar os vermes de cinco placas ricas do fator de crescimento nematoide, e transfira os vermes liberados para um tubo cônico para centrifugação. Suspenda os nematoides em três mililitros de tampão M9 fresco para quantificação do número de vermes no estágio larval L4, e sementes 700 L4 larvas em cada uma das seis placas secas de FUDR por cepa de verme, por composto. Quando todos os nematoides tiverem sido semeados, coloque as placas contendo as cepas para as quais a parlise é induzida por elevar a temperatura a 24 graus celsius por 24 horas.
No dia seguinte, ligue as luzes do palco do rastreador de vermes paralelo, e limpe o estágio de vidro do rastreador com 70% de etanol. Se não houver resíduo visível, remova a tampa da lente e use um espanador de ar para limpar a lente de imagem. Confirme se a câmera está corretamente conectada e instalada, e comece a gravar com o software de captura de imagem.
Ajuste as configurações da câmera para gravar 20 quadros por segundo, com os parâmetros de gravação mono-16 apropriados. Use uma placa de petri vazia de nove centímetros para garantir que o palco esteja ajustado para a altura correta e ajuste o estágio, se necessário. Em condições estéreis, adicione três mililitros de solução M9 a uma placa de triagem de motilidade, e use dois mililitros de solução M9 para lavar um terço da área de superfície de duas placas FUDR carregadas de nematoides do mesmo grupo experimental na placa de triagem.
Em seguida, coloque a placa de projeção no estágio do rastreador. Use um único verme para concentrar a câmera, e comece a gravar os animais. Quando a gravação estiver completa, descarte a placa de motilidade e marque as placas FUDR como sendo usadas uma vez antes de devolvê-las à incubadora.
Para analisar os dados de vídeo, abra a interface gráfica do software de análise de dados do worm tracker paralelo e use a função de navegação para carregar o vídeo de interesse. Selecione uma pasta de destino de saída e confirme que 600 a 1200 quadros estão definidos para uma análise de 30 segundos. Insira um fator de conversão de 0,029 pixels para milímetros para a imagem de uma placa de petri de nove centímetros em resolução total e selecione o algorithhm de rastreamento de manter morto.
Sob a guia de parâmetros de localização, defina as imagens de uso Z para 100, o preenchimento Z para 3, os pixels padrão para 54, o limiar para 9, a abertura para 1 e o fechamento para 2. Ajuste os parâmetros de filtragem para um tamanho mínimo de 20, um tamanho máximo de 180, e um verme como 0,94. Defina os parâmetros de trajetórias de formação a um movimento de distância máxima de 10, um comprimento mínimo de 150 e uma memória de 10.
Defina as curvas e os parâmetros de velocidade a um limiar de curva de 1,8, uma curva mínima de 0 e um quadro para estimar a velocidade de 150. Sintonize as estatísticas de vermes mortos a uma batida máxima por minuto de 5, e uma velocidade máxima de 1. Selecione a pasta de saída e selecione o número de quadros de saída para 50 e o tamanho da fonte para 10.
Use a função de exemplo para testar os parâmetros e tirar as imagens da amostra para verificar se os worms estão visíveis ao longo das oito etapas de limiar. Em seguida, inicie a função Iniciar trabalho" e combine os resultados individuais para todo o conjunto de dados para analisar os arquivos de resultado do teste, salvando os resultados através da função exportação para TSV. Este método permite a caracterização de fenotipos de nematode para grandes estudos populacionais de vários modelos de vermes de doenças neurodegenerativas, como Demência Frontotemporal, Doença de Parkinson, Doença de Alzheimer e Esclerose Lateral Amiotrófica.
Assim como a caracterização dos efeitos de moléculas terapêuticas potenciais, usando modelos de vermes de Parkinson e Doença de Alzheimer. A alta precisão dessas medidas é alcançada pelo aumento do número de vermes que podem ser analisados em comparação com os métodos tradicionais. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar para minimizar o tempo entre a adição dos vermes à motilidade e o início do rastreamento.
Após esse procedimento, outros métodos podem ser realizados para complementar os resultados e vincular-se à agregação de proteínas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo de doenças neurodegenerativas e desativadas, como Parkinson e Alzheimer, explorarem as aplicações de descoberta certas. Não se esqueça que trabalhar com FUDR pode ser extremamente perigoso e as precauções, como o uso de luvas de nitrito, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
