So kann diese Methode helfen, wichtige Fragen in einem Arzneimittel-Entdeckungsprozess zu beantworten, wie ein bestimmtes Medikament in einem lebenden Organismus verhält. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass große Probengrößen schnell und effizient gesiebt werden können. Diese Technik hat bereits einen großen Einfluss auf die Entdeckung von Arzneimitteln, indem sie eine hochquantitative Bewertung der Auswirkungen von Arzneimittelkandidaten ermöglicht.
Diese Methode bietet neuartige mechanistische Einblicke in das Beginn und fortschreiten von Fehlfalterkrankungen. Darüber hinaus kann diese Methode auch auf andere Systeme wie Alterung und genetische Screenings angewendet werden. Wir sind sehr begeistert von dieser Gelegenheit, neue physikalische Methoden in den Raum der Drogenentdeckung einzuführen.
Diese Demonstrationen dieser Methode sind von entscheidender Bedeutung, da die Siebschritte eine hohe Vertrautheit mit dieser novo automatischen Technik erfordern. Demonstriert wird das Verfahren von Sam Casford, einem Suchassistenten aus unserem Labor. Vor Beginn des Verfahrens 2,2 Millileter jeder Wirkstoffverbindung in der entsprechenden Konzentration auf sechs 5-Fluorodeoxyuridin- oder FUDR-Platten pro Schneckenstamm geben, indem Sie die Verbindung sorgfältig über die gesamte Oberfläche der Platte verteilen und die Platten unter sterilen Bedingungen trocknen.
Während die Platten trocknen, verwenden Sie 15 Milliliter M9-Puffer, um die Würmer von fünf reichen Nematoden-Wachstumsfaktorplatten zu waschen und die befreiten Würmer in ein konisches Rohr zur Zentrifugation zu übertragen. Unterbrechen Sie die Nematoden in drei Millilitern frischer M9-Puffer für die Quantifizierung der Anzahl der Würmer im L4-Larvenstadium und säen Sie 700 L4-Larven auf jede der sechs trockenen FUDR-Platten pro Schneckenstamm pro Verbindung. Wenn alle Nematoden gesät sind, legen Sie die Platten, die die Stämme enthalten, für die Parlyse induziert wird, indem die Temperatur 24 Stunden lang auf 24 Grad Celsius ansteigt.
Schalten Sie am nächsten Tag die Bühnenlichter des parallelen Schneckentrackers ein und reinigen Sie die Glasbühne des Trackers mit 70 Prozent Ethanol. Wenn keine sichtbaren Rückstände zurückbleiben, entfernen Sie die Linsenkappe und verwenden Sie einen Luftstaubsauger, um die Bildlinse zu reinigen. Vergewissern Sie sich, dass die Kamera korrekt angeschlossen und installiert ist, und starten Sie die Aufnahme mit der Bildaufnahmesoftware.
Passen Sie die Kameraeinstellungen so an, dass sie 20 Bilder pro Sekunde mit den entsprechenden Mono-16-Aufnahmeparametern aufzeichnen. Verwenden Sie eine leere, neun Zentimeter lange Petrischale, um sicherzustellen, dass die Bühne auf die richtige Höhe eingestellt ist, und passen Sie die Bühne bei Bedarf an. Unter sterilen Bedingungen drei Milliliter M9-Lösung zu einer Motilitätssiebplatte hinzufügen und zwei Milliliter M9-Lösung verwenden, um ein Drittel der Oberfläche von zwei nematoden geladenen FUDR-Platten aus derselben Versuchsgruppe in die Siebplatte zu waschen.
Legen Sie dann die Siebplatte auf die Tracker-Bühne. Verwenden Sie einen einzelnen Wurm, um die Kamera zu fokussieren, und beginnen Sie mit der Aufnahme der Tiere. Wenn die Aufzeichnung abgeschlossen ist, entsorgen Sie die Motilitätsplatte, und markieren Sie die FUDR-Platten einmal als verwendet, bevor Sie sie an den Inkubator zurückgeben.
Um die Videodaten zu analysieren, öffnen Sie die grafische Benutzeroberfläche der Parallel-Wurm-Tracker-Datenanalyse-Software, und verwenden Sie die Browserfunktion, um das Video von Interesse zu laden. Wählen Sie einen Ausgabezielordner aus, und bestätigen Sie, dass 600 bis 1200 Frames für eine 30-Sekunden-Analyse festgelegt sind. Legen Sie einen Umrechnungsfaktor von 0,029 Pixel zu Millimeter für die Abbildung einer neun Zentimeter großen Petrischale mit voller Auflösung ein, und wählen Sie den Keep Dead Tracking algorithhm aus.
Legen Sie unter der Registerkarte Ortungsparameter die Z-Use-Bilder auf 100, die Z-Auffüllung auf 3, die Standardpixel auf 54, den Schwellenwert auf 9, die Öffnung auf 1 und das Schließen auf 2 fest. Passen Sie die Filterparameter auf eine Mindestgröße von 20, eine maximale Größe von 180 und einen Wurm wie 0,94 an. Legen Sie die Parameter für Die Umformbahnen auf eine maximale Entfernungsbewegung von 10, eine Mindestlänge von 150 und einen Speicher von 10 fest.
Legen Sie die Biege- und Geschwindigkeitsparameter auf einen Biegeschwellenwert von 1,8, eine minimale Biegung von 0 und einen Rahmen fest, um die Geschwindigkeit von 150 zu schätzen. Stellen Sie die Statistik des toten Wurms auf einen maximalen Takt pro Minute 5 und eine maximale Geschwindigkeit von 1 ein. Wählen Sie den Ausgabeordner aus, und wählen Sie die Anzahl der Ausgaberahmen auf 50 und die Schriftgröße auf 10 aus.
Verwenden Sie die Beispielfunktion, um die Parameter zu testen und die Beispielbilder auszugeben, um zu überprüfen, ob die Würmer in den acht Schwellenwertschritten sichtbar sind. Dann initiieren Sie die Funktion Startjob", und kombinieren Sie die einzelnen Ergebnisse für den gesamten Datensatz, um die Testergebnisdateien zu analysieren, und speichern Sie die Ergebnisse über den Export in die TSV-Funktion. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Nematodenfenotypen für große Populationsstudien verschiedener Wurmmodelle neurodegenerativer Erkrankungen, wie Frontotemporale Demenz, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit und Amyotrophe Lateralsklerose.
Neben der Charakterisierung der Auswirkungen potenzieller therapeutischer Moleküle, mit Wurmmodellen der Parkinson- und Alzheimer-Krankheit. Die hohe Genauigkeit dieser Messungen wird durch die Erhöhung der Anzahl der Würmer erreicht, die im Vergleich zu herkömmlichen Methoden analysiert werden können. Während der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zeit zwischen dem Hinzufügen der Würmer zur Beweglichkeit und dem Beginn der Nachverfolgung zu minimieren.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden durchgeführt werden, um die Ergebnisse zu ergänzen und mit der Proteinaggregation in Verbindung zu bringen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der neurodegenerativen und fehlfaltenden Krankheiten, wie Parkinson und Alzheimer, um die richtigen Entdeckungsanwendungen zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit FUDR extrem gefährlich sein kann und die Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Nitrilhandschuhen, sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
