Así que este método puede ayudar a responder preguntas clave en un proceso de descubrimiento de fármacos sobre cómo se comporta un medicamento específico en un organismo vivo. La principal ventaja de esta técnica es que permite que los grandes tamaños de muestra se topan de forma rápida y eficiente. Esta técnica ya está teniendo un impacto importante en el descubrimiento de fármacos al permitir una evaluación altamente cuanititativa de los efectos de los candidatos a fármacos.
Este método proporciona nuevas perspectivas mecanicistas sobre la aparición y progresión de enfermedades que se desdoginan. Además, este método también se puede aplicar a otros sistemas, como el envejecimiento y los exámenes genéticos. Estamos muy emocionados por esta oportunidad de introducir nuevos métodos físicos en el espacio del descubrimiento de fármacos.
Estas demostraciones de este método son fundamentales ya que los pasos de cribado requieren una alta familiaridad con esta técnica automática novo. Demostrando el procedimiento estará Sam Casford, un asistente de búsqueda de nuestro laboratorio. Antes de comenzar el procedimiento, añadir 2,2 mililitros de cada compuesto de fármaco a la concentración adecuada a seis placas de 5-fluorodeoxyuridine o FUDR por cepa de gusano, extendiendo cuidadosamente el compuesto sobre toda la superficie de la placa, y secar las placas en condiciones estériles.
Mientras las placas se están secando, utilice 15 mililitros de tampón M9 para lavar los gusanos de cinco placas de factor de crecimiento de nematodos ricos, y transfiera los gusanos liberados a un tubo cónico para la centrifugación. Re-suspenda los nematodos en tres mililitros de tampón M9 fresco para la cuantificación del número de gusanos en la etapa larval L4, y sembrar 700 larvas L4 en cada una de las seis placas FUDR secas por cepa de gusano, por compuesto. Cuando se hayan sembrado todos los nematodos, coloque las placas que contienen las cepas para las que se induce la parlisis elevando la temperatura a 24 grados centígrados durante 24 horas.
Al día siguiente, encienda las luces del escenario del rastreador de gusanos paralelo y limpie la etapa de vidrio del rastreador con 70 por ciento de etanol. Si no queda ningún residuo visible, retire la tapa de la lente y utilice un plumero de aire para limpiar la lente de imagen. Confirme que la cámara está correctamente conectada e instalada, y comience a grabar con el software de captura de imágenes.
Ajuste la configuración de la cámara para grabar 20 fotogramas por segundo, con los parámetros de grabación mono-16 adecuados. Utilice una placa de petri vacía de nueve centímetros para asegurarse de que el escenario esté ajustado a la altura correcta, y ajuste la etapa si es necesario. En condiciones estériles, añada tres mililitros de solución M9 a una placa de cribado de motilidad y utilice dos mililitros de solución M9 para lavar un tercio de la superficie de dos placas FUDR cargadas con nematodos del mismo grupo experimental en la placa de cribado.
A continuación, coloque la placa de cribado en la etapa de seguimiento. Utilice un solo gusano para enfocar la cámara y comience a grabar a los animales. Una vez finalizada la grabación, deseche la placa de motilidad y marque las placas FUDR como utilizadas una vez antes de devolverlas a la incubadora.
Para analizar los datos de vídeo, abra la interfaz gráfica de usuario del software de análisis de datos de seguimiento de gusanos paralelo y utilice la función de navegación para cargar el vídeo de interés. Seleccione una carpeta de destino de salida y confirme que se han establecido de 600 a 1200 fotogramas para un análisis de 30 segundos. Inserte un factor de conversión de 0,029 píxeles a milímetros para la toma de imágenes de un plato petri de nueve centímetros a resolución completa, y seleccione el algoritmo de seguimiento de keep dead.
En la pestaña de parámetros de localización, establezca las imágenes de uso Z en 100, el relleno Z en 3, los píxeles estándar en 54, el umbral en 9, la apertura en 1 y el cierre en 2. Ajuste los parámetros de filtrado a un tamaño mínimo de 20, un tamaño máximo de 180 y un gusano como 0,94. Establezca los parámetros de trayectorias de conformado en un movimiento de distancia máxima de 10, una longitud mínima de 150 y una memoria de 10.
Establezca los parámetros de curvatura y velocidad en un umbral de umbral de pliegue de 1,8, un pliegue mínimo de 0 y un fotograma para estimar la velocidad de 150. Ajuste las estadísticas del gusano muerto a un ritmo máximo por minuto de 5, y una velocidad máxima de 1. Seleccione la carpeta de salida y seleccione el número de fotogramas de salida a 50 y el tamaño de fuente a 10.
Utilice la función de ejemplo para probar los parámetros y generar las imágenes de ejemplo para comprobar si los gusanos son visibles a lo largo de los ocho pasos de umbral. A continuación, inicie la función Iniciar trabajo y combine los resultados individuales de todo el conjunto de datos para analizar los archivos de resultados de la prueba, guardando los resultados a través de la función de exportación a TSV. Este método permite la caracterización de fenotipos de nematodos para grandes estudios poblacionales de diversos modelos de gusanos de enfermedad neurodegenerativa, como la demencia frontotemporal, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica.
Así como la caracterización de los efectos de las moléculas terapéuticas potenciales, utilizando modelos de gusanos de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. La alta precisión de estas mediciones se logra aumentando el número de gusanos que se pueden analizar en comparación con los métodos tradicionales. Al realizar este procedimiento, es importante recordar minimizar el tiempo entre la adición de los gusanos a la motilidad y el comienzo del seguimiento.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos para complementar los resultados y vincular con la agregación de proteínas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades neurodegenerativas y desdobridas, como el Parkinson y el Alzheimer, exploraran las aplicaciones de descubrimiento correctas. No olvide que trabajar con FUDR puede ser extremadamente peligroso y las precauciones, como el uso de guantes de nitrilo, siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.
