この方法は、単一ニューロンの分離とシーケンシングの分野における重要な障害を解決するのに役立ちます。ユーザー定義の脳領域から特定の集団または蛍光標識ニューロンの亜集団を収集することなど。この技術の主な利点は、それが目的の単一のニューロンが破片を汚染することなく捕捉されることを保証することです。
また、比較的穏やかで、従来のFACS選別の流体圧力を受けるとすぐに死ぬ脆弱なニューロンタイプにとって重要です。キャピラリープーラーを使用して、10〜15ミクロンの出口径で引っ張られたガラスマイクロキャピラリを準備することによって開始します。目的の板の直径を得るために毛細血管の先端を切断するために細かいはさみを使用してください。
次に、チューブコネクタを使用して、0.8ミリメートルの内径0.8ミリメートルの柔軟なシリコーンチューブの長さ120~150センチメートルを0.2ミクロンのPVDF膜シリンジフィルターと双方向チューブバルブに取り付けます。エアストーンを通して5%の二酸化炭素バランス酸素を泡立て、または溶液が完全にクリアされるまで500ミリリットルの冷蔵人工脳脊髄液またはACSFと酸素化物を調製します。ACSFの100ミリリットルを含む3つの150ミリリットルビーカーをそれぞれ準備します。
1つに、アクティビティブロッカーのカクテルを追加します。もう一つには、プロテアーゼのストレプトコッカス分率を1ミリリットル当たり1ミリグラムの最終濃度に加える。最終的なビーカーに、FBSを1%の最終濃度に加え、エアストーンを通して5%の二酸化炭素バランス酸素を含む酸素化物を加えます。
最後に、オープンフレームの上に転がすことによって出口径を減少させる3つの長い茎のパスツールピペットを作ります。小さなはさみで頭蓋骨を開き、皮質を損傷することなく細かい鉗子を使用して新鮮な脳を抽出することによって、安楽死させたマウスから脳を解剖する。切断の全期間の間に5%の二酸化炭素バランス酸素に取り付けられたエアストーンを残して冷蔵および酸素化されたACSFに脳を置く。
ビブラートメチャックに脳を置き、300ミクロンの厚さのコロナまたは矢状切片を切断します。必要な数のセクションを収集して、最低 10 ~ 50 個のラベル付きセルを取得します。ビーカーの中に置かれた綿メッシュのスライスホルダーにスライスを置き、酸素化されたACSFを浴びるようにします。
アクティビティブロッカーを備えたACSFを含むビーカーにスライスを移動し、エアストーンを使用して酸素をバブリングしながら室温で15〜20分間ブロックします。プロテアーゼ溶液を用いてACSFを含むビーカーにスライスを移動し、室温で軽度の消化を行います。消化後、活性ブロッカー溶液を含むビーカーにスライスを室温で5~10分間移動してプロテアーゼを洗い流します。
酸素をバブリングし続けます。次に、室温で1%FBSのACSFを含む100ミリメートルのペトリ皿を準備し、マイクロディセクションのために個々のセクションをディスクに移動します。蛍光解剖スコープでは、1対50の細胞を有する対象領域および層を微細解剖するために、一対の細い鉗子を使用します。
パスツールピペットを使用して、マイクロ解剖した部分をACSF溶液中の約0.8ミリリットルの1%FBSを含む2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。マイクロフュージチューブ内の解剖組織を室温で硝子化する。最大で始まり、最小の出口直径で終わる炎上したパスツールピペットのそれぞれで約10ストロークを実行します。
解約した細胞を酸素化したACSFを含む100ミリメートルのペトリ皿に分配し、細胞が徐々に沈着するまで5〜7分待ちます。GFPとRFP信号を解剖顕微鏡で観察します。明視野照明の下で形態を調べることによって破片を識別する。
小さな破片を含む細胞の領域が特定されたら、毛細血管を使用し、チューブに取り付けて、チューブバルブの端部を舌でブロックして細胞を選びます。次に、毛細血管を細胞の近くに置きます。毛細血管のブロックを解放し、すぐにキャピラリーアクションを使用して細胞をキャプチャするために再びブロックします。
新鮮な酸素化されたACSFで100ミリメートルのペトリ皿に毛細管を移動し、蛍光光学の下で毛細血管先端を観察しながらチューブに穏やかに吹き込み、細胞を皿に分配します。100~150個の細胞が収集されるまで収集手順を繰り返し、デブリなどの汚染物質が明視野差干渉コントラスト光学で最小限に抑えられるようにします。最後に、新鮮なマイクロキャピラリーピペットを毎回使用して、単一のセルを選択し、プライマー付きサンプルコレクションバッファーの1マイクロリットルを含む0.2マイクロフュージチューブに0.5マイクロリットル以下で排出します。
マイクロフュージチューブのピペットチップを破って、セルがコレクションバッファに残っていることを確認します。ドライアイスにチューブを置くことによって細胞を凍結します。RNA増幅のための処理までマイナス80°Cの冷凍庫で保管してください。
GABAERG性ニューロンは、マウス脳の帯状皮質から単離された。手動で選別されたニューロンから増幅されたRNAは、500塩基対をわずかに上回るピーク分布を有する200〜4,000塩基対の間の範囲となった。ビード精製後、cDNAライブラリは、ビーズを使用して2回目の精製によりさらにサイズが制限され、200塩基対未満の断片を排除し、約350塩基対でピークを迎えます。
シーケンスは、5番目の中央値に10倍、または6.9倍の10倍の10倍の平均マッピングされた読み取り1細胞当たりの読み取りを示した。UMIを使用してRNAを重複除去した後、各単一の細胞は5番目の中央値に1.0倍、または1.4倍の10〜1細胞当たりの平均ユニーク読み取り1.4回を持っていました。各単一細胞外部RNA制御コンソーシアムにおいて、RNAのスパイクを内部制御として使用し、サンプルに添加された分子の絶対数を計算した。
0.92の傾きと0.94の調整されたR二乗で観測されたカウントに対する入力の線形関係があった。この手順を使用して、1つのニューロンあたり平均約10,000個の遺伝子が検出され、6,000以上の遺伝子を検出する単一細胞の95%以上が検出されました。その開発後、この技術は、分子生物学者が明確に特徴付けられたマウス皮質インターニューロンのトランスクリプトームを探索する道を開き、細胞アイデンティティをコードする責任のある選択された遺伝子カテゴリを同定した。
