発生初期における多くの母体発現遺伝子の役割は現在不明である。この母体CRISPR技術は、母性効果遺伝子および発生におけるそれらの役割の迅速な同定を可能にする。RNAを単一の遺伝子に導く多重化により、研究者は単一世代で新しい母性効果表現型を特定することができます。
この研究は、初期の胚発生に必要な配偶子のmRNA転写産物の機能を理解するのに有益です。この技術の鍵は、1細胞期の早い段階で胚をマイクロインジェクションし、注入された胚に体細胞変異を起こすことができるガイドRNAの大部分を確認することです。各遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのガイドRNAテンプレートを作成するために、一定のオリゴヌクレオチドに分析物、T4 DNAポリメラーゼでオーバーハングを充填する。
4つのガイドRNAテンプレートを組み立てた後、DNAクリーンアップおよび濃縮キットを使用してそれらを精製および濃縮します。in-vitro T7転写キットを使用して、プールされたガイRNAテンプレートからsgRNA混合物を合成し、原稿に記載されているようにin vitro転写を実行します。sgRNAの完全性を検証するために、ミリリットルあたり0.5マイクログラムの1%アガロース、臭化エチジウムトリス-ホウ酸-EDTAゲルをキャストします。
固化したゲルをトリス-ホウ酸-EDTAランニングバッファーに入れます。1マイクロリットルのsgRNA混合物と1マイクロリットルのRNAゲルローディングバッファーを混合します。このサンプルをゲルに入れ、ゲルを100ボルトで5分間実行します。
紫外線を使用してバンドを視覚化します。野生型の交配とゼブラフィッシュの交配ボックスを設定します。オスとメスの魚を同じ水槽に入れますが、交配ボックスの仕切りを使用するか、ここに示すように、メスを産卵インサートの中に入れて分離します。
注射カクテルを組み立てた後、交配ボックスの仕切りを取り外すか、ここに示すように、オスをメスと同じ産卵インサートに入れて、オスとメスを交尾させます。胚を同期させるには、プラスチックストレーナーを使用して10分後に胚を収集し、1XE3培地を使用してペトリ皿にすすぎます。10〜15個の胚を取り除き、それらを別のペトリ皿に入れて、注射されていない対照として保管します。
残りの胚を注射プレートウェルに移します。1ナノリットルのタンパク質sgRNA溶液を、1細胞胚の発育中の芽球椎間板に注入します。鉗子を使用して詰まった針の先端を壊し、針を再調整して1ナノリットルのボーラスを排出します。
注射の翌日、注射されていないプレートから6つの健康な注射胚と2つの対照胚を収集します。各胚をPCRストリップチューブの単一ウェルに個別に入れ、チューブの上部にラベルを付けます。CRISPR-Cas9標的部位を含む100〜110塩基対のDNA断片を増幅するために、ガイド部位ごとに独自のスクリーニングプライマーを設計します。
可能であれば、ターゲット部位を増幅されたフラグメントの中央に配置し、より大きな欠失を識別できるようにします。4つのガイドターゲット部位のそれぞれについて、調製した5マイクロリットルの単一胚ゲノムDNAと20マイクロリットルのPCRミックスを使用して8つの25マイクロリットルのPCR反応を設定し、特異的スクリーニングプライマー混合物をガイドして、標的部位の体細胞変異を特定します。幅約0.625センチメートルのウェルを作成する櫛を使用して、2.5%アガロース、0.5マイクログラム/ミリリットルのエチジウムブロマイドトリス-ホウ酸-EDTAゲルをキャストします。
次いで、固化したゲルをトリス-ホウ酸-EDTAランニングバッファーを含む電気泳動チャンバーに入れる。5マイクロリットルの6Xローディング色素をPCR産物に加えます。この混合物を25マイクロリットルゲルにロードし、注入されたサンプルと対照サンプルが同じゲル列で実行されていることを確認します。
すべてのサンプルをロードしたら、トリス-ホウ酸-EDTAランニングバッファー1リットルあたり5マイクロリットルの臭化エチジウムをゲルボックスの正端に追加します。DNA禁止が解決するか、DNAがレーンの終わりに近づくまで、ゲルを120ボルトで実行します。母性効果表現型と母体CRISPRの胚を特定するために、実験前の午後に野生型の雄に対してF0注射された雌を設定し、標準的なゼブラフィッシュの交配ボックスで野生型の交配を対照します。
オスとメスの魚を同じ水槽に入れますが、交配ボックスの仕切りで分けるか、産卵インサートの中にメスを入れます。実験の朝に、交配ボックスの仕切りを取り外すか、オスをメスと同じ産卵インサートに入れて、オスとメスが交尾を開始できるようにします。産卵インサートを新鮮なシステム水を含む新しい交配タンクの底に移動して10分ごとに胚を収集し、個々のF0メスを識別するタグでタンクにラベルを付けます。
古い交配タンクを取り、Tストレーナーを通して水を注ぎ、1人の個々の10分間クラッチから胚を収集します。超越光源を備えた解剖顕微鏡の下で、発生中の胚を1時間ごとに、最初の6〜8時間、そして次の5日間は毎日観察します。潜在的な母体のCRISPR胚を1XE3培地を含むペトリ皿に移し、受精後24時間で形態学的表現型をアッセイし、受精後5日目に生存率をアッセイします。
実験前の午後、野生型のオスをメスから物理的に離しておくか、交配ボックスディバイダーを使用するか、メスを産卵インサートに入れることにより、F0メスの交配ペアを設定します。実験の朝に、物理パーティションを取り外して嵌合を開始します。産卵の最初の兆候で、オスとF0メスを分離して繁殖を中断し、分離されたF0メスをそれぞれ個別の交配ボックスに保管します。
体外受精後、母体のCRISPR表現型が観察されるまで一倍体胚を発達させ、それらの胚を別のペトリ皿に入れます。母体のCRISPR一倍体胚が特定されたら、受精後少なくとも6時間発生させます。少なくとも10個の母体CRISPR一倍体胚からゲノムDNAを抽出するには、単一の一倍体胚をPCRストリップチューブの個々のウェルに入れ、ウェルから余分なE3培地を取り除き、50マイクロリットルの50ミリモル水酸化ナトリウムを追加します。
胚を摂氏95度で20分間インキュベートし、摂氏4度まで冷却します。次に、pH 7.5の1モルの三塩化三塩化酸を5マイクロリットル加え、5〜10秒間ボルテックスします。どのガイドサイトにインデルが含まれているかを特定するには、4つのCRISPR/Cas9ターゲットサイトすべてを含むDNAフラグメントを増幅するシーケンシングプライマーを設計します。
準備した5マイクロリットルのゲノムDNAとシーケンシングプライマーを使用して、胚ごとに25マイクロリットルのPCR反応をセットアップします。PCRが終了したら、DNAクリーンアップおよび濃縮キットを使用して2つのサンプルを精製および濃縮し、フォワードシーケンシングプライマーおよびリバースシーケンシングプライマーを使用してDNAフラグメントをサンガーシーケンシングに送信します。ガイドRNAはすべて、母体CRISPRの生成中にガイドRNA間のオーバーラップ領域を最小限に抑えてクラスター化する必要があります。
インデルが作成された場合、アガロースゲルに注入されたサンプルでは塗抹標本が観察されますが、注入されていないコントロールでは観察されません。母体CRISPR法は、モトリー、tmi、およびオーラなどの既知の母体効果変異を表現コピーするために使用することができる。母体のCRISPR表現型に寄与する遺伝的病変を特定するために、UV処理された精子と体外受精を組み合わせて、母体のCRISPR一倍体を作成します。
一倍体の作成により、母体の対立遺伝子のサンガーシーケンシング、および母体のCRISPRインデルの同定が可能になります。非母性効果表現型を特定する場合、表現型がオフターゲットまたは非特異的効果ではなく、機能の喪失によって引き起こされる可能性を高めるため、複数のF0女性でそれを観察できることが不可欠です。母体効果表現型が同定された後、母体CRISPR胚を使用して、洞骨格やDNA分離など、初期胚発生のさまざまな側面への影響を調べることができます。
これにより、研究者は表現型の分子的原因を理解することができます。この方法は、未知の母体発現遺伝子の機能を1世代で直接テストし、初期胚発生中に作用するプロセスの理解を促進します。
