したがって、この方法は、タンパク質レベルで様々な環境下での活性化の状態を特徴付ける方法など、マクロファージ生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、標識のない定量法を用いてヒトマクロファージにおける多くのタンパク質の発現を異なる方法で得る機会を提供することです。手順を実証することは、私の研究室からマリー・マリアーとマガリ裁判所になります。
まず、15ミリリットルの密度勾配細胞分離溶液を2つの50ミリリットル遠心分離チューブのそれぞれに加え、LRSCを受ける前に溶液を室温まで温めることができます。密度は温度に依存するので、これは不可欠です。LRSCを50ミリリットルの遠心チューブに空にします。
1x PBSを50ミリリットルまで加え、混ぜます。次に、非常にゆっくりと、平衡密度勾配溶液の15ミリリットルの上にミックスの25ミリリットルを追加します。この手順では、フェーズを混在させないように注意してください。
血液は、この段階の妨害なしに密度勾配溶液に追加する必要があります。遠心分離チューブは、25分間、700Gで破断なし。密度勾配遠心分離の終わりに、下から上までの層は赤血球および顆粒球であり、ペレット、密度勾配溶液相、PBMCsの層、および希釈プラズマを形成する。
ピペットを使用して、プラズマ相を吸引せずに通過します。次いで、PBMC層を新しい50ミリリットルの遠心チューブに集める。300 G.吸上機で10分間、PBMCに最大50ミリリットルの1x PBSを加え、上清を吸引し、40ミリリットルのマクロファージ培地でペレットを再中断します。
マラセズチャンバーでPBMCsをカウチした後、実験を行うために必要な量のPBMCsを遠心チューブに移します。300 G.吸蔵で細胞を10分間遠心し、1000万PBMCsあたり80マイクロリットルの選別バッファーでペレットを再懸濁する。次に、1,000万PBCsあたり20マイクロリットルのCD14マイクロビーズを加えます。
よく混ぜ、一定の攪拌の下で摂氏4度で15分間インキュベートします。インキュベーションに続いて、洗浄工程として1000万PBMCsにつき1ミリリットルの仕分けバッファーを加え、遠心分離機を以前のように加えます。その後、上清を吸引し、1億PBMCsあたり500マイクロリットルの仕分バッファーでペレットを再懸濁する。
次に、セパレータの磁場に列を配置します。3ミリリットルの仕分けバッファーで列をすすいで準備します。セルのサスペンションを列に適用します。
次に、必要に応じて、その後の染色のためにラベルなし細胞を含む流れを収集します。3ミリリットルの仕分けバッファーでカラムを3回洗います。柱を乾かさないで注意してください。
次に、列の下にコレクション チューブを配置し、セパレータから取り外します。洗浄後、5ミリリットルの選別バッファーをカラムにピペットします。プランジャーをしっかりと柱に押し込み、磁気標識されたセルを直ちに洗い流します。
最後に、単球をめっきし、テキストプロトコルに記載されているようにマクロファージ偏光を実行する前に、新しい列でこれらの手順を繰り返します。酸素制御環境で単球とマクロファージを維持し、低酸素状態解析を行います。実験中に所望の酸素分圧下の細胞を維持するために低酸素ワーキングステーションを使用してください。
低酸素圧下で作業する場合、ステーションの下にすべての媒体と洗浄バッファーを準備し、液体中の正しい分圧を得るために十分に待つことが重要です。適合フードの下のバッファーで細胞のライシスを行います。4-12%ビストリスアクリルアミドゲルに各サンプルに300,000細胞の同等のタンパク質をロードします。
電気泳動の持続時間を制御して、各タンパク質サンプルを6つのゲルバンドに分割できるようにします。テキストプロトコルに記載されているように固定して染色した後、きれいなメスでタンパク質バンドを切除します。500マイクロリットルチューブに入れる前に、切除されたバンドをダイスします。
今度は、25ミリモルの重炭酸アンモニウム200マイクロリットルで3回、摂氏37度で20分間ゲルスライスを洗浄し、各ステップの間に重炭酸アンモニウムを捨てます。25ミリモル炭酸アンモニウムとアセトニトリルで1回の洗浄でこれに従ってください。次いで、100%アセトニトリル200マイクロリットルでゲル片を10分間脱水する。
10ミリモルDTTと25ミリモル炭酸アンモニウムを56°Cで45分間インキュベートします。次に、DTTを廃棄し、室温で暗闇の中で25ミリモル重炭酸アンモニウム中55ミリモルヨウドアセトアミドでゲル片をインキュベートします。アルキル化を止めるには、使用した溶液を廃棄し、25ミリモル重炭酸アンモニウムで20ミリモルDTTの200マイクロリットルの各ゲル片を室温で10分間インキュベートします。
25ミリモルの重炭酸アンモニウムの200マイクロリットルでゲル片を洗います。その後、100%アセトニトリルの200マイクロリットルで10分間脱水する。メーカーの指示に従ってトリプシン/Lys-Cミックスで摂氏37度で一晩タンパク質を消化します。
得られたペプチドをゲル片から、低吸収チューブで50%アセトニトリル50マイクロリットルを15分間添加して抽出する。50マイクロリットルの5%のギ酸を15分間加えた後、100%アセトニトリルの50マイクロリットルを15分間加える。低吸収チューブで各画分を引っ張って乾燥させて、ペプチドの吸収とサンプル損失を制限します。
テキスト プロトコルで詳しく説明されているように、さらに分析が行われるまで、サンプルを摂氏 80 度で保存します。ここに示されている代表的な純度は、CD14陽性単球の磁気ビーズ選択に続くフローサイトメトリーによって評価される。分化されたヒトマクロファージの位相コントラスト画像は、9日間培養した後の2つの異なる分極に対して得られた形態の不均一性を示す。
銀染色SDSページゲルを用いたオフゲル消化の例を示す。細胞溶解および溶液内消化後のタンパク質の評価は、溶解中の分解の欠如と消化の効率を示す。ここに示す、正の2の電荷を有するMSスペクトル上の質量電荷比597.29で見られるペプチドの衝突誘発解離スペクトルの例を示す。
このスペクトルから、対応する配列を決定した。解析後の最終結果は、微分発現タンパク質を使用するすべての偏光状態の階層的クラスタリングを表すヒートマップです。分析は、3%酸素状態のすべての分極で過剰発現するタンパク質のクラスターを明らかにします。
この手順を試みる際には、プロトコルを適合させるために、新しいサンプルに対してどのような分数を実行するかを最初に決定する必要があることを覚えておく必要があります。この研究を用いたプロテオミクスアプローチは、マクロファージ生物学の偏光研究の分野で最後の年に使用されてきたゲノムアプローチと相補的である。その開発後、この技術は、免疫学の分野の研究者がヒトおよび他の哺乳類における免疫細胞の活性化のさまざまな状態を探求する道を開きます。
DTTを使用することは危険である可能性があるので、この手順を行うには、適応されたフードの下で作業する必要があることを忘れないでください。
