Quindi questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei macrofagi, come come caratterizzare lo stato di attivazione in vari giacimento a livello proteico. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce l'opportunità di ottenere una diversa espressione di molte proteine nei macrofagi umani utilizzando un metodo di quantificazione privo di etichette. A dimostrare la procedura saranno Marie Malier e Magali Court del mio laboratorio.
Per iniziare, aggiungere 15 millilitri di soluzione di separazione cellulare gradiente di densità in ciascuno dei due tubi di centrifugazione da 50 millilitri in modo che la soluzione possa riscaldarsi a temperatura ambiente prima di ricevere l'LRSC. Questo è essenziale in quanto la densità dipende dalla temperatura. Svuotare l'LRSC in un tubo di centrifugazione da 50 millilitri.
Aggiungere 1x PBS fino a 50 millilitri e mescolare. Quindi, molto lentamente, aggiungere 25 millilitri della miscela sopra 15 millilitri di soluzione gradiente di densità equilibrata. Fare attenzione a non mescolare le fasi durante questo passaggio.
Il sangue deve essere aggiunto sulla soluzione di gradiente di densità senza alcun disturbo di questa fase. Centrifugare entrambi i tubi di centrifugazione per 25 minuti a 700 G senza pause. Alla fine della centrifugazione del gradiente di densità, gli strati dal basso verso l'alto sono gli eriociti e i granulociti, formando il pellet, la fase di soluzione del gradiente di densità, uno strato di PBPC e il plasma diluito.
Con una pipetta, passare attraverso la fase plasmatica senza aspirarla. Quindi, raccogliere lo strato PBMC in un nuovo tubo di centrifugazione da 50 millilitri. Aggiungere fino a 50 millilitri di 1x PBS ai PBBC come configurazione di lavaggio e centrifuga per 10 minuti a 300 G.Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 40 millilitri di mezzo macrofago.
Dopo aver formulato i PBBC in una camera Malassez, trasferire la quantità di PBBC necessaria per condurre l'esperimento in un tubo di centrifugazione. Centrifugare le cellule per 10 minuti a 300 G.Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 80 microlitri del tampone di cernita per 10 milioni di PBBC. Quindi, aggiungere 20 microlitri di microperline CD14 per 10 milioni di PBBC.
Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 gradi Celsius sotto agitazione costante. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di tampone di cernita per 10 milioni di PBPC come fase di lavaggio e centrifugare come prima. Quindi, aspirare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 500 microlitri di tampone di cernita per 100 milioni di PBBC.
Ora, posizionare una colonna nel campo magnetico del separatore. Preparare la colonna risciacquarla con tre millilitri di tampone di smistamento. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna.
Quindi raccogliere il flusso attraverso contenente celle senza etichetta per la colorazione successiva, se necessario. Lavare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone di smistamento. Fai attenzione a non asciugare la colonna.
Quindi, posizionare un tubo di raccolta sotto la colonna e rimuoverlo dal separatore. Dopo il lavaggio, pipettare cinque millilitri di tampone di smistamento nella colonna. Sciacquare immediatamente le cellule con etichetta magnetica spingendo saldamente lo stantuffo nella colonna.
Infine, ripetere questi passaggi con una nuova colonna prima di placcare i monociti ed eseguire la polarizzazione del macrofago come descritto nel protocollo di testo. Mantenere i monociti e i macrofagi in un ambiente controllato dall'ossigeno per eseguire analisi delle condizioni ipossiche. Utilizzare una stazione di lavoro ipossia per mantenere le cellule sotto la pressione parziale di ossigeno desiderata durante l'esperimento.
Quando si lavora sotto bassa pressione di ossigeno, è importante preparare tutti i mezzi e i tamponi di lavaggio sotto la stazione e attendere a sufficienza per ottenere la corretta pressione parziale nel liquido. Eseguire la llisi cellulare in un tampone sotto una cappa adattata. Caricare l'equivalente proteico di 300.000 cellule per ogni campione su gel di acrilammide 4-12%bis-tris.
Controlla la durata della migrazione elettroforetica per consentire a ogni campione proteico di dividersi in sei bande di gel come mostrato qui. Dopo aver riparato e macchiato come descritto nel protocollo di testo, asportare le bande proteiche con un bisturi pulito. Tagliare a dadini ogni banda asportata prima di metterli in tubi da 500 microliter.
Ora, lavare le fette di gel tre volte in 200 microlitri di bicarbonato di ammonio millimolare per 20 minuti a 37 gradi Celsius, scartando il bicarbonato di ammonio tra ogni passaggio. Seguire questo con un lavaggio in bicarbonato di ammonio millimolare e acetonitrile. Quindi, disidratare i pezzi di gel con 200 microlitridi di acetonitrile al 100% per 10 minuti.
Incubare ogni pezzo di gel con DTT da 10 millimolare e bicarbonato di ammonio millimolare per 45 minuti a 56 gradi Celsius. Quindi, scartare il DTT e incubare il pezzo di gel con 55 iodoacetamide millimolare in bicarbonato di ammonio millimolare per 35 minuti al buio a temperatura ambiente. Per fermare l'alchilazione, scartare la soluzione utilizzata e incubare ogni pezzo di gel con 200 microlitri di DTT da 10 millimolare in bicarbonato di ammonio millimolare per 10 minuti a temperatura ambiente.
Lavare i pezzi di gel in 200 microlitri di bicarbonato di ammonio millimolare. Quindi, disidratare con 200 microlitri di acetonitrile al 100% per 10 minuti. Digerire le proteine durante la notte a 37 gradi Celsius con Trypsin / Lys-C Mix secondo le istruzioni del produttore.
Estrarre i peptidi risultanti da pezzi di gel aggiungendo 50 microlitridi di acetonitrile al 50% per 15 minuti in tubi a basso assorbimento. Dopo aver aggiunto 50 microlitridi di acido formico al 5% per 15 minuti, aggiungere 50 microlitri di acetonitrile al 100% per 15 minuti. Tirare e asciugare ogni frazione in tubi a basso assorbimento per limitare l'assorbimento dei peptidi e la perdita del campione.
Archiviare i campioni a 80 gradi Celsius fino a un'ulteriore analisi come descritto nel protocollo di testo. Di seguito è riportata la purezza rappresentativa valutata dalla citometria del flusso a seguito della selezione di perline magnetiche di monociti positivi cd14. L'imaging a contrasto di fase di macrofagi umani differenziati mostra eterogeneità delle morfologie ottenute per due diverse polarizzazioni dopo nove giorni di coltura.
Viene mostrato un esempio di digestione off-gel utilizzando gel di pagina SDS macchiati d'argento. La valutazione delle proteine dallalisi cellulare e dopo la digestione in soluzione mostra l'assenza di degradazione durante lalisi e l'efficienza della digestione. Mostrato qui è un esempio di spettro di dissociazione indotto dalla collisione di un peptide trovato a rapporto massa-carica di 597,29 sullo spettro MS con una carica elettrica di due positivi.
Da questo spettro, è stata determinata la sequenza corrispondente. Il risultato finale dopo l'analisi è una mappa termica che rappresenta il clustering gerarchico di tutti gli stati di polarizzazione usando proteine espresse in modo differenziato. L'analisi rivela un ammasso di proteine sovrascritte in tutte le polarizzazioni nella condizione del 3% di ossigeno.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che devi prima decidere quale tipo di frazionamento eseguirai su nuovi campioni per adattare il tuo protocollo di conseguenza. L'approccio proteomico che utilizza questo lavoro è complementare agli approcci genomici che sono stati utilizzati negli ultimi anni nel campo degli studi di polarizzazione della biologia dei macrofagi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada al ricercatore nel campo dell'immunologia per esplorare i vari stati di attivazione delle cellule immunitarie nell'uomo e anche in altri mammiferi.
Non dimenticare che lavorare con DTT potrebbe essere pericoloso, quindi è necessario lavorare sotto una cappa adattata per eseguire questa procedura.
