따라서 이 방법은 단백질 수준에서 다양한 환경에서 활성화 상태를 특성화하는 방법과 같은 대식세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 라벨이 없는 정량화 방법을 사용하여 인간 대식세포에서 많은 단백질의 다른 발현을 얻을 수 있는 기회를 제공한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 마리 말리어와 마갈리 법원이 될 것입니다.
시작하려면 밀도 그라데이션 세포 분리 용액 15밀리리터를 각각 50밀리리터 원심분리 튜브에 추가하여 LRSC를 받기 전에 용액이 실온으로 따뜻해질 수 있도록 합니다. 밀도는 온도에 따라 달라지기 때문에 필수적입니다. LRSC를 50밀리리터 원심분리 튜브에 비웁힙시다.
최대 50밀리리터까지 1배 의 PBS를 추가하고 섞습니다. 그런 다음, 매우 천천히, 평형 밀도 그라데이션 솔루션의 15 밀리리터 위에 믹스의 25 밀리리터를 추가합니다. 이 단계에서 위상을 혼합하지 않도록 주의하십시오.
혈액은 이 단계의 방해 없이 밀도 그라데이션 용액에 추가되어야 합니다. 원심분리기는 700G에서 25분 동안 휴식을 취합니다. 밀도 그라데이션 원심분리의 끝에서, 바닥부터 상부까지의 층은 적혈구와 과립구이며, 펠릿, 밀도 그라데이션 솔루션 단계, PBMC 층 및 희석 된 플라즈마를 형성합니다.
파이펫으로 플라즈마 상을 흡입하지 않고 통과합니다. 그런 다음 PBMC 층을 새로운 50 밀리리터 원심 분리 튜브로 수집합니다. 300G.에서 10분 동안 세척 설정 및 원심분리기로 PBMC에 최대 50밀리리터를 추가하고 대식세포 배지 40밀리리터로 펠릿을 다시 정지시합니다.
말라세즈 챔버에 PBMC를 소파 후, 원심 분리 튜브에 실험을 수행하는 데 필요한 PBMC의 양을 전송. 300G.에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 1,000만 PBMC당 선별 버퍼의 80마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 그런 다음 1,000만 PBMC당 CD14 마이크로비드 20마이크로리터를 추가합니다.
잘 섞고 일정한 동요 하에서 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션에 따라 1,000만 PBMC당 1밀리리터의 정렬 버퍼를 세척 단계로 추가하고 원심분리기를 이전과 같이 추가합니다. 그런 다음, 1억 PBMC당 500마이크로리터의 선별 버퍼에서 상체를 흡인하고 다시 중단한다.
이제 분리기의 자기장에 열을 배치합니다. 정렬 버퍼의 세 밀리리터로 컬럼을 헹구어 서 컬럼을 준비합니다. 셀 서스펜션을 열에 적용합니다.
그런 다음 필요한 경우 후속 염색을 위해 레이블이 없는 셀을 포함하는 흐름을 수집합니다. 정렬 버퍼의 세 밀리리터로 컬럼을 세 번 세척합니다. 열을 말리지 않도록 주의하십시오.
그런 다음 컬럼 아래에 수집 튜브를 놓고 분리기에서 제거합니다. 세척 후, 파이펫 5 밀리리터의 정렬 버퍼는 열로. 플런저를 컬럼으로 단단히 밀어 자석으로 표시된 세포를 즉시 플러시합니다.
마지막으로 단핵구를 도금하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 대식세포 편광을 수행하기 전에 새 열로 이러한 단계를 반복합니다. 저산소 상태 분석을 수행하기 위해 산소 조절 환경에서 단핵구및 대식세포를 유지한다. 실험 중에 원하는 산소 부분 압력하에서 세포를 유지하기 위해 저산소작업스테이션을 사용한다.
저산소압하에서 작업할 때는 역 아래의 모든 미디어 및 세척 버퍼를 준비하고 액체에서 올바른 부분 압력을 얻기에 충분히 기다리는 것이 중요합니다. 적응된 후드 아래 버퍼에서 셀 리시스를 수행합니다. 4-12%비스 트리스 아크릴아미드 젤에 각 샘플에 대해 300, 000 세포의 단백질을 적재한다.
전기 전광 이동의 지속 시간을 제어하여 각 단백질 샘플이 여기에 표시된 대로 6개의 젤 밴드로 분할되도록 합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 고정 및 염색 한 후 깨끗한 메스로 단백질 밴드를 소비합니다. 500 마이크로 리터 튜브에 배치하기 전에 각 소비밴드를 주사위.
이제 젤 슬라이스를 25밀리머암모늄 중탄산염 200마이크로리터에서 섭씨 37도에서 20분간 세 번 세척하여 각 단계 사이에 중탄산암보네이트를 폐기합니다. 25 밀리몰라 암모늄 중탄산염과 아세토닐릴에 한 번 씻고 이 것을 따르십시오. 그런 다음 10분 동안 100% 아세토나이트200 마이크로리터로 젤 조각을 탈수합니다.
각 젤 조각을 10 밀리몰러 DTT와 25 밀리머 암모늄 중탄산염을 섭씨 56도에서 45분간 배양합니다. 그런 다음 DTT를 버리고 실온에서 어둠 속에서 35 분 동안 25 밀리마일라 요오도 아세타미드로 젤 조각을 배양하십시오. 알킬루션을 중지하려면 사용된 용액을 폐기하고 각 젤 조각을 실온에서 10분 동안 25밀리알라 암모늄 중탄산염에 10밀리머 DTT200 마이크로리터로 배양합니다.
25 밀리모어 암모늄 중탄산염의 200 마이크로 리터에 젤 조각을 씻어. 그런 다음 10 분 동안 100 % 아세토나이트의 200 마이크로 리터로 탈수하십시오. 제조업체의 지시에 따라 트립신/Lys-C 믹스로 하룻밤 사이에 단백질을 섭씨 37도에서 소화합니다.
저흡수 튜브에서 15분 동안 50마이크로리터50마이크로리터를 첨가하여 젤 조각에서 펩티드를 추출합니다. 15분 동안 50마이크로리터5%의 마이크로리터를 15분 동안 첨가한 후 15분 동안 100% 아세토나이트50마이크로리터를 추가합니다. 펩티드와 시료 손실의 흡수를 제한하기 위해 저흡수 튜브에서 각 분획을 당기고 건조시하십시오.
텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 추가 분석이 될 때까지 샘플을 섭씨 80도에 저장합니다. 여기에 표시된 대표적인 순도는 CD14 양성 단핵구의 자기 비드 선택에 따라 유동 세포측정에 의해 평가된다. 분화된 인간 대식세포의 위상 대비 화상 진찰은 문화의 9 일 후에 2개의 다른 편광을 위한 얻어진 변종의 이질성을 보여줍니다.
은 염색 SDS 페이지 젤을 사용한 오프젤 소화의 예가 표시됩니다. 세포 용해 및 용액 소화 후단백질의 평가는 용해 시 분해가 없는 것을 나타내며 소화효율을 나타낸다. 여기에 도시된 펩타이드의 충돌 유도 해리 스펙트럼은 양수 2의 전하를 가진 MS 스펙트럼에서 597.29의 질량 대 전하 비율에서 발견되는 펩티드의 예입니다.
이 스펙트럼으로부터, 해당 서열이 결정되었다. 분석 후 최종 결과는 차별화된 표현 단백질을 사용하여 모든 편광 상태의 계층적 군집을 나타내는 열맵이다. 분석은 3%의 산소 조건에서 모든 편광에서 과발현되는 단백질의 클러스터를 제시합니다.
이 절차를 시도하는 동안 프로토콜을 조정하기 위해 새 샘플에서 수행할 분획종류를 먼저 결정해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 일을 사용하여 proteomic 접근은 대식세포 생물학 편광 연구 결과의 필드에 있는 마지막 년 도중 이용된 게놈 접근에 상호 보완입니다. 개발 후, 이 기술은 인간과 또한 그밖 포유동물에서 면역 세포의 활성화의 각종 상태를 탐구하는 면역학의 필드에 있는 연구원을 위한 쪽을 포장합니다.
DTT와 함께 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하려면 적응된 후드 아래에서 작업해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
