Ainsi, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie macrophage, comme la façon de caractériser l’état d’activation sous divers environnements au niveau des protéines. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre la possibilité d’obtenir l’expression différente de nombreuses protéines dans les macrophages humains en utilisant la méthode de quantification sans étiquette. Marie Malier et Magali Court de mon laboratoire feront la démonstration de la procédure.
Pour commencer, ajoutez 15 millilitres de solution de séparation cellulaire de gradient de densité dans chacun des deux tubes de centrifugation de 50 millilitres afin que la solution puisse chauffer à température ambiante avant de recevoir le LRSC. Ceci est essentiel car la densité dépend de la température. Videz le LRSC dans un tube de centrifugation de 50 millilitres.
Ajouter 1x PBS jusqu’à 50 millilitres et mélanger. Puis, très lentement, ajouter 25 millilitres du mélange sur le dessus de 15 millilitres de solution de gradient de densité équilibrée. Veillez à ne pas mélanger les phases au cours de cette étape.
Le sang doit être ajouté sur la solution de gradient de densité sans aucune perturbation de cette phase. Centrifugeuse les deux tubes de centrifugation pendant 25 minutes à 700 G sans pauses. À la fin de la centrifugation du gradient de densité, les couches du bas vers le haut sont les érythrocytes et les granulocytes, formant la pastille, la phase de solution de gradient de densité, une couche de PBMCs, et le plasma dilué.
Avec une pipette, passer à travers la phase plasmatique sans l’aspirer. Ensuite, rassemblez la couche PBMC dans un nouveau tube de centrifugation de 50 millilitres. Ajouter jusqu’à 50 millilitres de 1x PBS aux PBMCs comme installation de lavage et centrifugeuse pendant 10 minutes à 300 G.Aspirer le supernatant et suspendre à nouveau la pastille en 40 millilitres de macrophage moyen.
Après avoir couché les PBMCs dans une chambre Malassez, transférez la quantité de PBMCs nécessaires à la conduite de l’expérience dans un tube de centrifugation. Centrifuger les cellules pendant 10 minutes à 300 G.Aspirate le supernatant et re-suspendre la pastille dans 80 microlitres du tampon de tri pour 10 millions de PBMCs. Ajoutez ensuite 20 microlitres de microbilles de CD14 pour 10 millions de PBMCs.
Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius sous agitation constante. Après l’incubation, ajouter un millilitre de tampon de tri pour 10 millions de PMC comme étape de lavage, et centrifugeuse comme avant. Ensuite, aspirez le supernatant et suspendez la pastille en 500 microlitres de tampon de tri pour 100 millions de PBMCs.
Maintenant, placez une colonne dans le champ magnétique du séparateur. Préparez la colonne en la rinçant avec trois millilitres de tampon de tri. Appliquez la suspension cellulaire sur la colonne.
Puis recueillir le flux à travers contenant des cellules non étiquetées pour la coloration ultérieure, si nécessaire. Lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon de tri. Veillez à ne pas sécher votre colonne.
Ensuite, placez un tube de collecte sous la colonne et retirez-le du séparateur. Après le lavage, pipette cinq millilitres de tampon de tri dans la colonne. Rincez immédiatement les cellules étiquetées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne.
Enfin, répétez ces étapes avec une nouvelle colonne avant de placage des monocytes et d’effectuer la polarisation macrophage tel que décrit dans le protocole de texte. Maintenir les monocytes et les macrophages dans un environnement contrôlé par l’oxygène pour effectuer une analyse de l’état hypoxique. Utilisez un poste de travail d’hypoxie afin de maintenir les cellules sous la pression partielle d’oxygène désirée pendant l’expérience.
Lorsque vous travaillez sous basse pression d’oxygène, il est important de préparer tous les supports et les tampons de lavage sous la station, et d’attendre suffisamment pour obtenir la pression partielle correcte dans le liquide. Effectuez la lyse cellulaire dans un tampon sous un capot adapté. Chargez l’équivalent protéique de 300 000 cellules pour chaque échantillon sur des gels acrylamides de 4-12%bis-tris.
Contrôler la durée de la migration électrophoretic pour permettre à chaque échantillon de protéines de se diviser en six bandes de gel comme indiqué ici. Après fixation et coloration décrites dans le protocole textuel, excisez les bandes protéiques avec un scalpel propre. Couper chaque bande excisée en dés avant de la placer dans 500 tubes de microlitres.
Maintenant, lavez les tranches de gel trois fois dans 200 microlitres de bicarbonate d’ammonium millimolaire pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius, jetant le bicarbonate d’ammonium entre chaque étape. Suivez ceci avec un lavage dans le bicarbonate de ammonium millimolar et l’acétyonitrile. Ensuite, déshydratez les morceaux de gel avec 200 microlitres de 100% acétyonitrile pendant 10 minutes.
Incuber chaque morceau de gel avec 10 millimolar DTT et 25 millimolar ammonium bicarbonate pendant 45 minutes à 56 degrés Celsius. Ensuite, jetez la TNT et incubez le morceau de gel avec de l’iodoacetamide de 55 millimollaires en bicarbonate d’ammonium millimolaire pendant 35 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Pour arrêter l’alkylation, jetez la solution utilisée et incubez chaque morceau de gel avec 200 microlitres de 10 millimolar DTT en bicarbonate d’ammonium millimolaire pendant 10 minutes à température ambiante.
Laver les morceaux de gel en 200 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 25 millimlaires. Ensuite, déshydratez avec 200 microlitres de 100% acetonitrile pendant 10 minutes. Digérer les protéines pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec Trypsin /Lys-C Mix selon les instructions du fabricant.
Extraire les peptides qui en résultent des morceaux de gel en ajoutant 50 microlitres de 50% d’acétyonitrile pendant 15 minutes dans des tubes à faible absorption. Après avoir ajouté 50 microlitres d’acide 5% formic pendant 15 minutes, ajouter 50 microlitres de 100% acetonitrile pendant 15 minutes. Tirez et séchez chaque fraction dans des tubes à faible absorption pour limiter l’absorption des peptides et la perte d’échantillon.
Stockez les échantillons à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient analysés plus en détail dans le protocole texte. On y voit la pureté représentative évaluée par cytométrie d’écoulement à la suite de la sélection magnétique des monocytes positifs CD14. L’imagerie de contraste de phase des macrophages humains différenciés montrent l’hétérogénéité des morphologies obtenues pour deux polarisations différentes après neuf jours de culture.
Un exemple de digestion hors gel à l’aide de gels de page SDS teintés d’argent est montré. L’évaluation des protéines de la lyse cellulaire et après la digestion en solution montre l’absence de dégradation pendant la lyse et l’efficacité de la digestion. Il est indiqué ici un exemple d’un spectre de dissociation induit par collision d’un peptide trouvé au rapport masse-charge de 597,29 sur le spectre de la SP avec une charge électrique de deux positifs.
À partir de ce spectre, la séquence correspondante a été déterminée. Le résultat final après analyse est une carte thermique représentant le regroupement hiérarchique de tous les états de polarisation à l’aide de protéines exprimées différemment. L’analyse révèle un groupe de protéines sur-exprimées dans toutes les polarisations dans l’état d’oxygène de 3%.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que vous devez d’abord décider quel type de fractionnement vous effectuerez sur de nouveaux échantillons pour adapter votre protocole en conséquence. L’approche protéomique utilisant ces travaux est complémentaire aux approches génomiques qui ont été utilisées au cours des dernières années dans le domaine des études de polarisation de la biologie des macrophages. Après son développement, cette technique ouvre la voie à un chercheur dans le domaine de l’immunologie pour explorer les différents états d’activation des cellules immunitaires chez l’homme et aussi chez d’autres mammifères.
N’oubliez pas que travailler avec la TNT pourrait être dangereux, vous devez donc travailler sous un capot adapté pour faire cette procédure.
