この方法は、局所組織微小環境を代表する小胞の供給源を提供することで、生体内の細胞外小胞の役割に関する重要な質問に対処するのに役立ちます。組織ミリュー内の細胞外小胞の研究は、生体内の病態生理学的プロセスにおける細胞外小胞の生理学的役割およびそれらの変化の理解をさらに深めることができる。ポータル静脈の缶取の視覚的なデモンストレーションは、静脈の小さなサイズが操作を回すことを困難にするので有用である。
石黒香理博士との手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の研究技術者アイリーン・ヤンです。手順を開始する前に、麻酔マウスの手足を固定し、注射器ポンプチューブの自由端に設定された翼を持つ採血の23ゲージ針を接続します。70%エタノールとアルコールパッドでマウスの腹部の皮膚をきれいにし、はさみを使用して胸部の前部から骨盤の骨までマウスを開き、内臓に損傷を与えないように注意してください。
綿製のチップアプリケーターを使用して、腸を腹腔の右側に静かに移動して、門脈静脈と下静脈を露出させ、湾曲した鉗子を使用して門脈の下に糸を置きます。縫合糸でゆるやかに結び目を結び、カニュールの後にシンチする準備をし、溶液がカニューレ針の先端に達するまで40°CのHBSSでカニューレを満たします。合字の下5〜10ミリメートルの門脈にカニューレを挿入し、縫合糸でカニューレを固定します。
1 分の流量あたり 1 ~ 2 ミリリットルで注入を開始します。カニューレが正しく配置されていれば、肝臓はブランシュになり始めます。下の大静脈を切り、肝臓内の過度の液体を排出させます。
HBSSの完全な50ミリリットルが次の5分間にわたって肝臓を介して浸透するまで、ゆっくりと毎分8ミリリットルに流量を増やす。HBSSがなくなる直前に、調理した40度のコラゲナーゼ4液をパーフューゼスビーカーに変更し、鉗子を使用して5秒間隔で下の静脈に一過圧を加え、肝臓を膨らまし、組織の消化と解離を助けます。消化が進むにつれて、肝臓は膨らみ、白くなります。
綿の先端のアプリケーターで穏やかに探した後に落ち込んだままになったら、ポンプを止めてカニューレを取り外します。肝臓から胆嚢を取り除き、胆嚢組織を引き裂かないように注意し、きれいなはさみと鉗子を使用して肝臓をPBSの無菌10センチメートル培養皿に収穫する。穏やかな洗浄の後、新鮮なコラゲターゼ4溶液を含む新しい10センチメートルの培養皿に肝臓を移し、肝臓組織から細胞を解離するために穏やかに揺れながら肝臓を引き裂くために2つのきれいな鉗子を使用する。
臓器全体が断片化したら、3ミリリットルの注射器を使用して、未消化の肝臓片が振り落とされるまで組織スラリーをトリチュレートします。得られたセル溶液を70ミクロンのナイロンメッシュストレーナーを通して50ミリリットルの円錐チューブに注ぎ、残りの細胞を収集するためにHBSSで皿を洗います。洗浄液を単一細胞懸濁液でプールし、遠心分離により肝細胞を除去する。
その後、上清を新しい50ミリリットルチューブに移します。他の細胞を除去するために、新しい50ミリリットルの円錐管に移る前に上清を遠心分離する。別の遠心分離で死んだ細胞を取り除き、上澄み物を丸底チューブに移して細胞の破片および凝集物を取り除く。
上清をポリカーボネート超遠心チューブに移し、2番目の最終的な超遠心分離のためにPBSの約20ミリリットルでペレットを再懸濁します。その後、小胞がすぐに分析されない場合は、PBSの1ミリリットルで細胞外ナノベシクルペレットをマイナス80°Cの貯蔵のために再懸濁する。単一のマウス肝臓から、この方法は、ナノ粒子追跡分析によって決定されるように、1ミリリットル当たり10倍の平均で1.74〜4倍の10から12番目までの細胞外小胞濃度を生み出す。
単離された肝臓組織の細胞外小胞の平均サイズは157.7ナノメートルで、ナノ粒子追跡解析により144.5ナノメートルのモードサイズと、100~600ナノメートルの細胞外小胞サイズです。このアプローチを用いて単離される細胞外小胞は下流の適用に適しており、さらなる特徴付けには、電気顕微鏡による形態学的評価またはそれらの表面マーカーまたは内容の分析が含まれる。
