牺牲纤维膜细胞培养生产细胞外基质纤维

该协议允许从培养细胞系生产散装细胞外基丝，允许研究细胞基质相互作用，以及研究这种生物材料对伤口修复的潜力。这些合成纤维可以避免针对合成材料的异物反应，同时仍然利用丰富的纺织制造技术，创造出广泛的编织植入材料。演示这个程序的将是卡桑德拉·里德，一个研究生，来自我的实验室。

在细胞播种之前，在121摄氏度下将中空纤维膜在121摄氏度下进行30分钟，随后在PBS中用50毫升的牛血浆纤维素在PBS中用5%二氧化碳进行1小时的处理。在孵育结束时，使用无菌微剪刀将纤维切割到6厘米或以下，并使用装有21量针的1毫升注射器将10倍至第五纤维细胞直接植入中空纤维膜的亮度。将六种种子纤维放入直径为六英寸的培养皿中，并在37摄氏度的二氧化碳中短暂孵育种子纤维。

五分钟后，将纤维从培养箱转移到一个新的六厘米培养皿中，含有纤维细胞培养基培养基，辅以L-抗坏血酸，L-抗坏血酸2磷酸盐，并在细胞培养箱中转换生长因子β1长达三周。在孵化结束时，使用钳子将培养的纤维转移到单个闪烁小瓶中，并倾斜每个小瓶，允许将多达五毫升的 N-甲基-2-pyrolidone 添加到小瓶的一侧。然后使用血清移液器从每根纤维中缓慢吸出N-甲基-2-丙酮，将纤维转移到新的闪烁小瓶中，以第二次浸入新鲜的N-甲基-2-丙酮。

第三次浸入后，以类似的方式在脱离子水中冲洗产生的细胞外基体螺纹三次，将一块三英寸长、一英寸宽、1/23 英寸厚的硅橡胶与中央八×四毫米矩形模具放在标准的三×一英寸玻璃显微镜幻灯片上。高压灭菌后，将每个细胞外基质纤维并排放在八乘四毫米硅胶模具中，直到没有明显的开放空间。将模具放入50毫升锥形管中，将纤维冷冻在负80摄氏度，直到完全冻结。

对于去细胞化，在1%的硫酸钠中孵育模具，在室温下用温和的搅拌机孵育24小时。第二天，用三毫升PBS洗涤，冲洗提取的细胞外基质，用新鲜准备好的DNA/RNA消化缓冲液填充模具，在4摄氏度下孵育6小时。在消化结束时，吸消化液，并在无菌PBS中冲洗模具三次，如证明。

第三次洗涤后，在PBS中孵育10%青霉素-链霉素的脚手架在4摄氏度过夜，然后冻结在50毫升锥形管在负80摄氏度约1小时。当网状物完全冻结后，将去细胞化的细胞外网状在一夜之间冻干，或直到完全干燥，然后将冻干的脚手架转移到生物安全罩内的无菌容器中，并在四摄氏度下储存，直到使用。这里展示了使用本协议制造的聚糖中空纤维膜的横向横截面，展示了不对称膜的手指形毛孔外层和内层特征。

在成纤维细胞播种和培养后，N-甲基-2-丙酮冲洗被证明，半透明线程的细胞外基质生产。在整个三周的培养期内，产生细胞的细胞外基质在中空纤维膜内仍然可行。提取的矩阵在水合时具有半透明外观，呈现非白色颜色和纤维外观，在网格装配和冻干时具有粗纵向对齐。

最关键的一步是在N-甲基-2-丙酮溶剂中培养的空心纤维膜的溶解过程，以提取细胞外基质。该方法产生的材料可用于制造组织工程植入物，用于研究临床前研究中组织的修复。该协议中使用的 N-甲基-2-丙酮是皮肤和眼睛刺激物，因此建议您使用亚硝基手套、护目镜、实验室外套处理该化学品，并在烟罩内处理。