Ce protocole permet la production de filaments de matrice extracellulaire en vrac à partir de lignées cellulaires de culture, permettant la recherche sur les interactions de matrice cellulaire, ainsi que la recherche sur le potentiel de ce biomatériau pour la réparation des plaies. Ces fibres synthétiques peuvent éviter la réponse du corps étranger dirigée contre les matériaux synthétiques, tout en puisant dans le riche répertoire des techniques de fabrication textile pour créer une large gamme d’implantables tissés. Cassandra Reed, une étudiante diplômée de mon labo, démontrera la procédure.
Avant d’ensemencer les cellules, autoclave les membranes creuses de fibre à 121 degrés Celsius pendant 30 minutes, suivie d’un traitement avec 50 millilitres de fibronectine plasmatique bovine dans PBS à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% pendant une heure. À la fin de l’incubation, utiliser des micro ciseaux stériles pour couper les fibres à six centimètres ou moins, et utiliser une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 21 pour ensemencer une fois 10 à la cinquième cellule fibroblaste directement dans le lumina des membranes de fibres creuses. Placez six fibres ensemencées dans une boîte de Pétri de six pouces de diamètre et incubez brièvement les fibres ensemencées à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone à 5 %.
Après cinq minutes, transférer les fibres de l’incubateur dans un nouveau plat petri de six centimètres contenant milieu de culture fibroblaste complété par de l’acide L-ascorbique, l’acide l-ascorbique 2 phosphate, et la transformation du facteur de croissance bêta 1 pour un jusqu’à trois semaines dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation, utiliser des forceps o transférer les fibres de culture dans des flacons de scintillation individuels, et incliner chaque flacon pour permettre l’ajout de jusqu’à cinq millilitres de N-Méthyl-2-pyrrolidone sur le côté des flacons. Ensuite, utilisez une pipette sérologique pour aspirer lentement le N-Méthyl-2-pyrrolidone de chaque fibre, et transférer les fibres dans de nouveaux flacons de scintillation pour une deuxième immersion en N-Méthyl-2-pyrrolidone fraîche.
Après la troisième immersion, rincez les fils de matrice extracellulaires qui en résultent trois fois dans de l’eau déionisée de la même manière, et placez un moule rectangulaire de trois pouces de long et d’un pouce de large de 1/23e pouce d’épaisseur avec un moule rectangulaire central de huit par quatre millimètres sur une lame de microscope en verre standard de trois par un pouce. Après l’autoclaving, mentez chaque fibre extracellulaire de matrice côte à côte dans le moule en silicone de huit par quatre millimètres jusqu’à ce qu’il n’y ait aucun espace ouvert visible. Placez le moule dans un tube conique de 50 millilitres et congelez les fibres à 80 degrés Celsius négatifs jusqu’à ce qu’elles soient complètement gelées.
Pour la décellularisation, incuber le moule dans du sulfate de dodecyl à 1 % de sodium pendant 24 heures à température ambiante sur un rocker avec une légère agitation. Le lendemain, rincez la matrice extracellulaire extraite avec trois lavages en trois millilitres de PBS par lavage, et remplissez le moule d’ADN/ARN fraîchement préparés pour une incubation de six heures à quatre degrés Celsius. À la fin de la digestion, aspirer la solution de digestion et rincer le moule trois fois dans PBS stérile comme démontré.
Après le troisième lavage, incuber les échafaudages à 10% pénicilline-streptomycine en PBS à quatre degrés Celsius pendant la nuit avant de geler dans un tube conique de 50 millilitres à 80 degrés Celsius négatif pendant environ une heure. Lorsque le maillage est complètement gelé, lyophiliser le maillage extracellulaire décellulaire pendant la nuit, ou jusqu’à ce qu’il soit complètement sec, et transférer les échafaudages lyophilisés dans un contenant stérile dans un capot de biosécurité et les conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient utilisés. Ici, une section transversale d’une membrane de fibre creuse polysulfone fabriquée à l’aide de ce protocole est montrée, présentant des couches externes et intérieures de pores en forme de doigt caractéristiques d’une membrane asymétrique.
Après l’ensemencement et la culture des cellules fibroblastes, le rinçage n-méthyl-2-pyrrolidone tel que démontré, des fils translucides de matrice extracellulaire sont produits. Les cellules productrices de matrice extracellulaire restent viables à l’intérieur des membranes creuses de fibre tout au long de la période de culture de trois semaines entière. La matrice extraite a un aspect translucide lorsqu’elle est hydratée, présentant une couleur blanc éteint et un aspect fibreux avec un alignement longitudinal brut sur l’assemblage du maillage et la lyophilisation.
L’étape la plus critique est le processus de dissolution des membranes de fibres creuses cultivés dans le solvant N-Méthyl-2-pyrrolidone afin d’extraire la matrice extracellulaire. Le matériau produit par cette méthode peut être utilisé pour fabriquer des implants d’ingénierie tissulaire pour étudier la réparation des tissus dans des études précliniques. Le N-Méthyl-2-pyrrolidone utilisé dans ce protocole est un irritant pour la peau et les yeux, et il est donc recommandé que vous manipuliez le produit chimique à l’aide de gants de nitrile, lunettes, un manteau de laboratoire, et le manipuler dans un capot de fumée.
