이 프로토콜은 배양 된 세포주에서 대량 세포 외 매트릭스의 필라멘트의 생산을 허용, 세포 매트릭스 상호 작용에 대한 연구를 허용, 뿐만 아니라 상처 수리에 대한이 생체 물질의 잠재력에 대한 연구. 이러한 합성 섬유는 합성 물질에 대한 이물질 반응을 피할 수 있으며 섬유 제조 기술의 풍부한 레퍼토리에서 도출하여 다양한 직조 이식물질을 만들 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 카산드라 리드 (Cassandra Reed)가 될 것입니다.
세포를 파종하기 전에 중공 섬유막을 섭씨 121도에서 30분 동안 오토클레이브한 다음 PBS에서 50밀리리터의 소 플라즈마 섬유네틴을 1시간 동안 57도의 이산화탄소로 치료합니다. 인큐베이션의 끝에서, 멸균 마이크로 가위를 사용하여 섬유를 6센티미터 이하로 자르고, 21 게이지 바늘을 장착한 1밀리리터 주사기를 사용하여 10번에서 5번째 섬유아세포 세포를 속여 중공 섬유막의 루미나로 직접 시드한다. 6개의 시드 섬유를 직경 6인치 페트리 접시에 넣고, 시성 섬유를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 잠시 배양합니다.
5분 후, 인큐베이터에서 섬유아세포 배양 배지를 함유한 새로운 6센티미터 페트리 접시로 섬유아세포 배양 배지를 함유한 새로운 6센티미터 페트리 접시로 옮기고, L-아스코르빅산 2 인산염으로 보충하고, 세포 배양 인큐베이터에서 최대 3주 동안 성장인자 베타 1을 변형시킨다. 인큐베이션의 끝에서, 포셉을 사용하여 배양된 섬유를 개별 신자극 유리알로 옮기고 각 유리병을 기울여 바이알의 측면 아래로 최대 5밀리리터를 첨가할 수 있도록 한다. 그런 다음 세로지학적 파이펫을 사용하여 각 섬유에서 N-Methyl-2-pyrrolidone을 천천히 흡인하고 섬유를 새로운 반짝임 바이알로 옮겨 신선한 N-Methyl-2-pyrrolidone에 두 번째 침수를 합니다.
세 번째 침수 후, 결과 세포 외 매트릭스 스레드를 유사한 방식으로 탈이온 화 된 물에 세 번 헹구고 중앙 8 x 4 밀리미터 직사각형 금형을 표준 3 x 1 인치 유리 현미경 슬라이드에 3 인치 길이의 1 인치 너비 1/23 인치 두께의 실리콘 고무 조각을 놓습니다. 오토클레이브 후, 각 세포외 매트릭스 섬유를 8x 4 밀리미터 실리콘 몰드에 나란히 놓아 보이는 열린 공간이 없을 때까지 놓습니다. 금형을 50밀리리터 원내 튜브에 넣고 완전히 얼어 붙을 때까지 소음 80도에서 섬유를 동결합니다.
탈세포화를 위해, 부드러운 동요와 로커에 실온에서 24 시간 동안 1 %의 나트륨 도데딜 황산염에 금형을 배양. 다음 날, 세척당 PBS 3밀리리터에 3개의 세척으로 추출된 세포외 매트릭스를 헹구고, 4도에서 6시간 동안 갓 준비된 DNA/RNA 소화 버퍼로 금형을 채웁니다. 소화가 끝나면 소화 용액을 흡인시키고 입증된 바와 같이 멸균 PBS에서 금형을 세 번 헹구는다.
세 번째 세척 후, PBS에서 10%의 페니실린-연쇄절제술을 받은 후 밤새 섭씨 4도에서 비계를 배양한 후, 약 1시간 동안 마이너스 80°C.에서 50밀리리터 원뿔튜브로 동결합니다. 메쉬가 완전히 고정되면, 세포외 외 세포 메쉬를 밤새 또는 완전히 건조 할 때까지 lyophilized 스캐폴드를 전달하여 생체 안전 후드 내의 멸균 용기에 옮기고 사용할 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오. 여기서 이 프로토콜을 사용하여 제작된 폴리설폰 중공 섬유막의 횡면이 비대칭 멤브레인의 특징인 손가락모양의 기공의 외부 및 내부 층을 나타낸다.
섬유아세포 세포 파종 및 배양 후, N-메틸-2-피롤리돈 린싱이 입증된 바와 같이 세포외 매트릭스의 반투명 실이 생성됩니다. 세포 외 매트릭스 생성 세포는 전체 3 주 배양 기간 동안 중공 섬유 막 내부에 실행 가능한 남아있다. 추출된 매트릭스는 수화시 반투명 한 외관을 가지며, 메쉬 조립 및 lyophilization에 대한 총 세로 정렬로 오프 화이트 색상과 섬유 모양의 외관을 나타낸다.
가장 중요한 단계는 세포외 매트릭스를 추출하기 위해 N-메틸-2-피롤리돈 용매에서 배양 된 중공 섬유 막의 용해 과정이다. 이 방법에 의해 생성된 물질은 전임상 연구에서 조직의 수리를 조사하기 위해 조직 설계 임플란트를 제조하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 N-Methyl-2-pyrrolidone은 피부와 눈 자극제이므로 니트릴 장갑, 고글, 실험실 코트를 사용하여 화학 물질을 처리하고 연기 후드 내에서 처리하는 것이 좋습니다.
