Este protocolo permite a produção de filamentos de matriz extracelular a granel a partir de linhas de células cultivadas, permitindo pesquisas sobre interações matriciais celulares, bem como pesquisas sobre o potencial deste biomamaterial para reparação de feridas. Essas fibras sintéticas podem evitar a resposta do corpo estranho direcionada contra materiais sintéticos, enquanto ainda se dedem do rico repertório de técnicas de fabricação têxtil para criar uma ampla gama de implantáveis tecidos. Demonstrando o procedimento será Cassandra Reed, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Antes de semear as células, autoclave as membranas de fibra oca a 121 graus Celsius por 30 minutos, seguido de tratamento com 50 mililitros de fibronectina de plasma bovino em PBS a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por uma hora. No final da incubação, use micro tesouras estéreis para cortar as fibras a seis centímetros ou menos, e use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 21 para semear uma vez 10 às quintas células do fibroblasto diretamente na luminária das membranas de fibra oca. Coloque seis fibras semeadas em uma placa de Petri de seis polegadas de diâmetro, e incuba brevemente as fibras semeadas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.
Após cinco minutos, transfira as fibras da incubadora para uma nova placa de Petri de seis centímetros contendo meio de cultura fibroblasto suplementado com ácido L-ascórbico, ácido L-ascórbico 2 fosfato, e transformando o fator de crescimento beta 1 por até três semanas na incubadora de cultura celular. No final da incubação, use fórceps o transferir as fibras cultivadas em frascos de cintilação individuais, e inclinar cada frasco para permitir a adição de até cinco mililitros de N-Methyl-2-pyrrolidone ao lado dos frascos. Em seguida, use uma pipeta sorológica para aspirar lentamente o N-Metil-2-pyrrolidone de cada fibra, e transferir as fibras para novos frascos de cintilação para uma segunda imersão em N-Methyl-2-pyrrolidona fresca.
Após a terceira imersão, enxágüe os fios de matriz extracelular resultantes três vezes em água desionizada de forma semelhante, e coloque um pedaço de vidro de três polegadas de comprimento e uma polegada de largura de 1/23 polegadas de espessura com um molde retangular central de oito por quatro milímetros em um microscópio de vidro padrão de três por uma polegada. Após a autoclavagem, coloque cada fibra de matriz extracelular lado a lado no molde de silicone de oito por quatro milímetros até que não haja espaço aberto visível. Coloque o molde em um tubo cônico de 50 mililitros e congele as fibras a 80 graus Celsius negativos até congelar completamente.
Para descelularização, incubar o molde em sulfato de dodecil de 1%sódio por 24 horas em temperatura ambiente em um roqueiro com agitação suave. No dia seguinte, enxágue a matriz extracelular extraída com três lavagens em três mililitros de PBS por lavagem, e encha o molde com tampão de digestão DNAs/RNAs recém-preparado para uma incubação de seis horas a quatro graus Celsius. No final da digestão, aspire a solução de digestão e enxágue o molde três vezes em PBS estéril como demonstrado.
Após a terceira lavagem, incubar os andaimes em 10% Penicilina-Estreptomicina na PBS a quatro graus Celsius durante a noite antes de congelar em um tubo cônico de 50 mililitros a 80 graus Celsius negativos por cerca de uma hora. Quando a malha estiver completamente congelada, liofilize a malha extracelularizada descelularizada durante a noite, ou até secar completamente, e transfira os andaimes liofilizados para um recipiente estéril dentro de uma capa de bio segurança e armazene a quatro graus Celsius até o uso. Aqui é mostrada uma seção transversal de uma membrana de fibra oca de polisulfone fabricada usando este protocolo, exibindo camadas externas e internas de poros semelhantes a dedos característicos de uma membrana assimétrica.
Após a semeadura e cultura das células fibroblastos, são produzidos fios translúcidos de matriz extracelular. As células produtoras da matriz extracelular permanecem viáveis dentro das membranas de fibras ocas durante todo o período de cultura de três semanas. A matriz extraída tem uma aparência translúcida quando hidratada, exibindo uma cor off-white e aparência fibrosa com um alinhamento longitudinal grosseiro sobre montagem de malha e liofilização.
O passo mais crítico é o processo de dissolução das membranas de fibra oca cultivadas no solvente N-Methyl-2-pyrrolidona, a fim de extrair a matriz extracelular. O material produzido por este método pode ser usado para a fabricação de implantes de tecido projetado para investigar a reparação de tecidos em estudos pré-clínicos. O N-Metil-2-pyrrolidone usado neste protocolo é um irritante de pele e olhos, e, portanto, é recomendável que você manuseie o produto químico usando luvas de nitrito, óculos, um jaleco e manuseie-o dentro de um capô de fumaça.
