Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung von Filamenten von massenhaften extrazellulären Matrix aus kultivierten Zelllinien, so dass die Erforschung von Zellmatrix-Wechselwirkungen, sowie die Erforschung des Potenzials dieses Biomaterials für die Wundreparatur. Diese synthetischen Fasern können die Fremdkörperreaktion auf synthetische Materialien vermeiden, während sie immer noch aus dem reichen Repertoire an textilen Herstellungstechniken schöpft, um eine breite Palette von gewebten Implantables zu schaffen. Demonstriert das Verfahren wird Cassandra Reed, eine Studentin aus meinem Labor.
Vor der Aussaat der Zellen, Autoklav die Hohlfasermembranen bei 121 Grad Celsius für 30 Minuten, gefolgt von der Behandlung mit 50 Milliliter Rinderplasma Fibronectin in PBS bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für eine Stunde. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine sterile Mikroschere, um die Fasern auf sechs Zentimeter oder weniger zu schneiden, und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 21-Spur-Nadel ausgestattet ist, um ein mal 10 bis fünf literazupfende Fibroblastenzellen direkt in die Leuchtdichte der Hohlfasermembranen zu säen. Legen Sie sechs gesäte Fasern in eine Petrischale mit sechs Zoll Durchmesser und bebrüten die gesäten Fasern kurzzeitig bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid.
Nach fünf Minuten die Fasern aus dem Inkubator in eine neue sechs Zentimeter lange Petrischale mit Fibroblastenkulturmedium, ergänzt durch L-Ascorbinsäure, L-Ascorbinsäure 2 Phosphat, und Umwandlung des Wachstumsfaktors Beta 1 für bis zu drei Wochen im Zellkultur-Inkubator übertragen. Am Ende der Inkubation, verwenden Zangen o übertragen die kultivierten Fasern in einzelne Szintillationsfläschchen, und kippen jede Durchstechflasche, um die Zugabe von bis zu fünf Milliliter N-Methyl-2-Pyrrolidon auf der Seite der Fläschchen zu ermöglichen. Dann verwenden Sie eine serologische Pipette, um langsam das N-Methyl-2-Pyrrolidon aus jeder Faser zu saugen, und übertragen Sie die Fasern in neue Szintillationsfläschchen für ein zweites Eintauchen in frisches N-Methyl-2-Pyrrolidon.
Nach dem dritten Eintauchen spülen Sie die resultierenden extrazellulären Matrixfäden dreimal in deionisiertem Wasser auf ähnliche Weise ab und legen Sie ein drei Zoll langes, ein Zoll breites, 1/23 Zoll dickes Stück Silikonkautschuk mit einer zentralen rechteckigen Form von acht mal vier Millimetern auf ein Standard-Glasmikroskop-Dia mit drei mal einem Zoll. Legen Sie nach dem Autoklavieren jede extrazelluläre Matrixfaser nebeneinander in die acht mal vier Millimeter große Silikonform, bis kein sichtbarer Freiraum vorhanden ist. Legen Sie die Form in ein 50 Milliliter konisches Rohr, und frieren Sie die Fasern bei negativen 80 Grad Celsius, bis vollständig gefroren.
Zur Dezellularisierung die Form in 1% Natriumdodecylsulfat für 24 Stunden bei Raumtemperatur auf einer Wippe mit sanfter Rührung inkubieren. Am nächsten Tag spülen Sie die extrahierte extrazelluläre Matrix mit drei Wäschen in drei Millilitern PBS pro Wäsche ab und füllen Sie die Form mit frisch zubereiteten DNAs/RNAs Verdauungspuffer für eine sechsstündige Inkubation bei vier Grad Celsius. Am Ende der Verdauung, aspirieren Sie die Verdauungslösung und spülen Sie die Form dreimal in sterilen PBS wie gezeigt.
Nach der dritten Wäsche die Gerüste in 10% Penicillin-Streptomycin in PBS bei vier Grad Celsius über Nacht bebrüten, bevor sie in einem 50 Milliliter konischen Rohr bei negativen 80 Grad Celsius etwa eine Stunde frieren. Wenn das Netz vollständig eingefroren ist, lyophilisieren Sie das dezelluläre extrazelluläre Netz über Nacht oder bis zum völligen Trocknen, und übertragen Sie die lyophilisierten Gerüste in einen sterilen Behälter innerhalb einer Bio-Sicherheitshaube und lagern Sie bei vier Grad Celsius bis zum Gebrauch. Hierwird wird ein querer Querschnitt einer mit diesem Protokoll hergestellten Polysulfon-Hohlfasermembran gezeigt, die äußere und innere Schichten fingerähnlicher Poren aufweist, die für eine asymmetrische Membran charakteristisch sind.
Nach der Fibroblastenzellaussaat und -kultur werden, wie gezeigt, N-Methyl-2-Pyrrolidon-Spülung, transluzente Fäden extrazellulärer Matrix hergestellt. Die extrazellulären Matrix produzierenden Zellen bleiben innerhalb der Hohlfasermembranen während des gesamten dreiwöchigen Kulturzeitraums lebensfähig. Die extrahierte Matrix hat ein transluzentes Aussehen, wenn hydratisiert, zeigt eine off-weiße Farbe und faseriges Aussehen mit einer groben Längsausrichtung auf Netzmontage und Lyophilisierung.
Der kritischste Schritt ist der Auflöseprozess der kultivierten Hohlfasermembranen im N-Methyl-2-Pyrrolidon-Lösungsmittel, um die extrazelluläre Matrix zu extrahieren. Das mit dieser Methode hergestellte Material kann zur Herstellung von gewebetechnischen Implantaten zur Untersuchung der Gewebereparatur in präklinischen Studien verwendet werden. Das N-Methyl-2-Pyrrolidon, das in diesem Protokoll verwendet wird, ist ein Haut- und Augenreizungsmittel, und daher wird empfohlen, dass Sie die Chemikalie mit Nitrilhandschuhen, Einer Brille, einem Labormantel und einem Rauchhaube behandeln.
