この方法は、脳内血流を脳全体のニューロンおよびグリア活動の燃料補給に直接結びつける実質動脈内皮の機能に関するより良い洞察を提供する。細動脈内皮に対する明確な技術的利点は、個々の脳内皮細胞およびそれらのそれぞれの細胞小器官間の形態学的寸法およびカルシウムおよび電気シグナル伝達の分解能の向上である。当初、脳内皮の単離および検査は非常に困難である。
しかし、忍耐と献身を伴う十分な練習でこのテクニックを習得することは可能です。ビーカーまたはペトリ皿に入れた冷たい解剖溶液で孤立した脳を洗浄し、脳の表面から残りの血液を除去する。冷たい解剖溶液を入れたチャンバー内に腹側を上向きに置き、実質細動脈を単離する。
実質細動脈を単離するには、深さ50センチメートル以上の木炭注入シリコンポリマーコーティングを含むペトリ皿内の冷たい解剖溶液中のスチールピンで単離された脳を固定する。MCAの周囲に鋭く整列した解剖ハサミで両半球から脳組織の長方形を切り取り、組織セグメントの上部がウィリスの円からの分岐点を過ぎていることを確認する。MCAをスチールピンで上に向けて脳組織を皿に固定します。
ピンの近くに慎重に浅い切開を行い、小さな鉗子でピアを取り除き、一方の端から他方の端に向かって静かに剥がします。MCAから分岐した実質細動脈を有する孤立した鯨毛をピンで皿に注意深く固定し、実質細動脈を注意深く解剖する。残りの遠位枝を切り取り、細動脈が清潔で組織が付着していないことを確認します。
酵素消化のためにこのきれいな無傷の細動脈を使用してください。あるいは、酵素消化のために各細動脈を2つに切断し、必要に応じて内皮チューブを調製する。動脈セグメントの部分消化のために、無傷の動脈セグメントを、パパイン、ジチオエリスリトール、コラゲナーゼ、およびエラスターゼを含む10ミリリットルのガラス管内の1ミリリットルの解離溶液に入れる。
動脈セグメントを摂氏34度で10〜12分間インキュベートする。動脈内皮管を単離するには、マイクロシリンジインジェクタに取り付けられた摩砕ピペットをチャンバ内の解離溶液中に置き、消化された血管セグメントの一端の近くに配置する。穏やかな摩砕のためにポンプコントローラで毎秒1〜3ナノリットルの範囲内で速度を設定します。
100倍〜200倍の倍率を維持しながら、動脈セグメントをピペットに引き抜き、次いで注入して外生細胞および平滑筋細胞を解離させる。すべての平滑筋細胞が解離し、内皮細胞のみが無傷のチューブとして残るまで、血管セグメントを粉砕する。マイクロマニピュレーターでは、ホウケイ酸ガラスピン留めピペットでチャンバー内のガラスカバースリップに内皮チューブの両端を固定して内皮膜電位を測定し、4倍の対物レンズを通して見ながら、動脈内皮チューブの細胞のすぐ上の鋭い電極先端をマイクロマニピュレーターで流れる生理的塩溶液に慎重に配置します。
倍率を徐々に400倍に上げ、必要に応じて電極先端の位置を変えます。マイクロマニピュレータを用いて、鋭利な電極の先端を内皮管のセルの1つに静かに挿入し、電気計を用いてVMの記録を開始する。内皮安静VMがマイナス30〜マイナス40ミリボルトで安定したら、実験目的ごとに所望の薬理学的薬剤を適用する。
内皮チューブに原形質膜または所望の細胞小器官用の蛍光トラッカーを摂氏37度で15〜30分間ロードする。新鮮なスーパーフュージョン生理塩溶液で細胞を洗浄し、それぞれの色素の励起波長で顕微鏡下で生細胞を画像化する。内皮機能は、摂氏37度で強力なプリン作動性受容体アゴニストである薬理学的物質MTAに応答して細胞内カルシウムおよび膜電位を測定することによって評価した。
1マイクロモルMTAを印加すると、細胞内カルシウム濃度は、付随する過分極とともに急速に増加する。さらに、無傷の内皮を、細胞形態を調べるために可視化のために蛍光トラッカーと共に摂氏37度でインキュベートした。生内皮細胞イメージングは、原形質膜および核に対する共染色を示した。
原形質膜を小胞体蛍光染色と共に染色し、それによって原形質膜の近接するERの明らかな重なりの領域がオレンジ色に見える。実験者は、損傷した細動脈が無傷の内皮管を絶対に得られないため、細動脈の損傷を避けるために、解剖および単離中に注意する必要があります。手順に続いて、細胞は、蛍光抗体による固定免疫組織化学または細胞小器官および膜脂質の生細胞染色に使用され得る。
この技術は、生理学の基礎レベルで脳血流のメカニズムを理解するための新しい情報を生成し、治療のための病理学への遷移を選択します。
