このプロトコルは、従来のエレクトロスパンナノファイバーメンブレンを2Dから3Dに変え、これまで実現されなかった亜臨界CO2流体の減圧を通じて報告した。この方法は、水溶液および化学反応の使用、複数のステッププロセス、封入された生体分子の活性の喪失、疎水性ポリマーの制限など、以前のアプローチに関連する多くの問題を排除します。この手順のデモンストレーションは、私の研究室のポスドクであるShixuan Chenです。
20ミリリットルのガラス管で、ジクロロメタンとDMFの溶媒混合物に2グラムのPCLを溶解し、濃度10%で4対1の比率を有する。溶液がはっきりするまで、ガラス管をラボの回転子に入れます。ソリューションは一晩中混ざるかもしれません。
エレクトロスピニング装置をセットアップするには、まず、21ゲージの鈍い針を取り付けた20ミリリットルのシリンジにPCL溶液を追加します。シリンジに空気がなく、切り出したチューブがないことを確認します。針先から12センチメートルの地面コレクターで回転するスチールドラムを置きます。
ワニのクリップを使用して、直流高圧電源を針に接続し、コレクタが接地されていることを確認します。PCL溶液の20ミリリットルの場合、直径20.27ミリメートル、毎時0.5ミリリットルの流量を使用してシリンジポンプのパラメータを設定します。針の先端に液滴が形成されているかどうかを確認します。
紡ぎ場から 20 センチ離れた地盤コレクターとの間に 20 キロボルトの電位を適用します。2,000 RPMで回転するドラムに整列したナノファイバーマットを集める。PCLナノファイバーマットは、厚さ約1ミリメートルに達したら回収します。
PCLナノファイバーマットを液体窒素に5分間浸します。PCLナノファイバーマットを液体窒素に入れ、PCLナノファイバーマットに直径0.5ミリメートルのパンチを入れておいてください。PCLナノファイバーマットを液体窒素に5分間入れます。
エッジの変形を避けるために液体窒素に沈めながら、鋭い外科用はさみを使用して1センチメートルの正方形にマットを1センチメートルにカットします。カットマットを約1グラムのドライアイスを入れ、30ミリリットルの遠心管に入れ。蓋をしっかりとキャップし、ドライアイスを液体二酸化炭素に変えます。
チューブに液体が形成されたら、キャップを開けて圧力を素早く解放します。ふくらんだ足場をチューブから取り出して観察します。ドライアイスを備えた新しい遠心分離管に足場を置き、繰り返しの要望の厚さが達成されます。
細胞とのインキュベーション前に、拡大したナノファイバースキャフォールドをエチレンオキシドで殺菌します。従来の2DエレクトロスパンナノファイバーマットをサブクリティカルCO2液の減圧によって3D足場に拡大する効果は、2回目の処理後に左側に示されています。足場の厚さは、1回のCO2処理で2.5ミリメートルに未処理の場合、1ミリメートルから2CO2処理で19.2ミリメートルに増加しました。
足場の空隙率は、未処理のマットの79.5%から最初の治療後の92.1%に増加し、2回目の治療後に99.0%に増加した。これは、足場への細胞浸透の程度、したがって再生を誘導するその有効性が、空隙率に大きく依存するため重要である。SEM画像は、未処理の2Dマットの密に詰まったフィブラ構造が、CO2で膨張した後、整列したナノファイバーを持つ秩序ある層状構造に変換されたことを明らかにした。
Vevoでは、ラットに対して正方形配列の穴を有するCO2拡張ナノ繊維足場の皮下移植によって実施された。これにより、細胞移動と穴内での増殖、および拡張中に作成されたナノファイバー層内のさらなる浸潤が可能になります。移植後の第1週から4週目まで、拡大した足場は、従来のナノファイバーマットと比較して形成された血管の数および多核巨細胞の有意な増加を示した。
この手順に従って、成長因子、アミノ調節化合物、止血剤、および抗微小管剤を含む異なる分子をナノファイバーマットに組み込み、亜臨界CO2流体中に展開することができる。このような機能拡張された拡大ナノ繊維足場は、止まり止め、感染の予防と治療、免疫学、組織再生および修復などの他の科学分野における新たな疑問を探求するために使用することができる。有機溶剤は有毒であり、化学フードで取り扱う必要があります。
さらに、サブクリティカルなCO2流体の高圧に耐えることができる容器を膨張に使用する必要があります。
