Este protocolo reportó la transformación de nanofibremembranas tradicionales de electrospun de 2D a 3D, a través de la despresurización del fluido de CO2 subcrítico que no se realizó previamente. Este método elimina muchos problemas asociados con enfoques anteriores, incluyendo el uso de soluciones acuosas y reacciones químicas, procesos de pasos múltiples, pérdida de actividad de moléculas biológicas encapsuladas y limitaciones de polímeros hidrófobos. Demostrando este procedimiento está Shixuan Chen, un postdoctorado de mi laboratorio.
En un tubo de vidrio de 20 mililitros, disolver dos gramos de PCL en una mezcla de disolvente de diclorometano y DMF, con una relación de cuatro a uno a una concentración del 10 por ciento. Coloque el tubo de vidrio en un rotador de laboratorio hasta que la solución se despeje. La solución puede mezclarse durante la noche.
Para configurar el Aparato de Electrospinning, primero, agregue la solución PCL a una jeringa de 20 mililitros con una aguja contundente de calibre 21 conectada. Asegúrese de que no haya aire en la jeringa y tubos disociados. Coloque un tambor de acero giratorio con el colector de tierra a 12 centímetros de la punta de la aguja.
Con clips de cocodrilo, conecte la fuente de alimentación de alta tensión de corriente directa a la aguja y asegúrese de que el colector esté conectado a tierra. Para los 20 mililitros de solución PCL, establezca el parámetro de la bomba de jeringa utilizando un diámetro de 20,27 milímetros y un caudal de 0,5 mililitros por hora. Compruebe si las gotas se están formando en la punta de la aguja.
Aplicar un potencial eléctrico de 20 kilovoltas entre la hilera y un colector de tierra situado a 20 centímetros de distancia de la hilera. Recoger las alfombrillas de nanofibra alineadas en un tambor, girando a 2.000 RPM. Recoger las alfombrillas de nanofibra PCL una vez que alcanzan un espesor de aproximadamente un milímetro.
Sumerja las alfombrillas de nanofibra PCL en nitrógeno líquido durante cinco minutos. Mantenga las alfombrillas de nanofibra PCL en nitrógeno líquido y las alfombrillas de nanofibra PCL punzonadas con un punzón de 0,5 milímetros de diámetro. Coloque las alfombrillas de nanofibra PCL en nitrógeno líquido durante cinco minutos.
Corte las esteras en cuadrados de un centímetro por un centímetro utilizando tijeras quirúrgicas afiladas mientras se sumerge en nitrógeno líquido para evitar la deformación de los bordes. Coloque la estera cortada en un tubo centrífugo de 30 mililitros con aproximadamente un gramo de hielo seco. Tapa firmemente la tapa y deja que el hielo seco se convierta en dióxido de carbono líquido.
Una vez que el líquido se ha formado en el tubo, libere rápidamente la presión abriendo la tapa. Retire y observe el andamio hinchado del tubo. Coloque el andamio en un nuevo tubo centrífugo con hielo seco, y repita util se logra el espesor del deseo.
Esterilice los andamios de nanofibra expandido en óxido de etileno antes de la incubación con las células. La eficacia de la expansión de las esteras tradicionales de nanofibra de electrospun 2D en andamios 3D a través de la despresurización del líquido de CO2 subcrítico se muestra a la izquierda después del segundo tratamiento. El espesor del andamio aumentó de un milímetro cuando no se trata a 2,5 milímetros con un tratamiento de CO2, a 19,2 milímetros con dos tratamientos de CO2.
La porosidad de los andamios aumentó del 79,5 por ciento para las esteras no tratadas, al 92,1 por ciento después del primer tratamiento, al 99,0 por ciento después del segundo tratamiento. Esto es significativo porque el grado de penetración celular en un andamio, y por lo tanto su eficacia para inducir la regeneración, depende en gran medida de la porosidad. Las imágenes SEM revelan que la estructura fibular densamente empaquetada de las esteras 2D no tratadas se transformó en estructuras ordenadas y estratificadas con nanofibras alineadas después de la expansión con CO2.
En Vevo los estudios se llevaron a cabo mediante la implantación subcutánea de andamios de nanofibra expandido por CO2 con agujeros de matriz cuadrada a ratas. Esto permite la migración celular y la proliferación dentro de los agujeros, así como una mayor infiltración dentro de las capas de nanofibra que se crearon durante la expansión. De la semana uno a cuatro postimplantación, los andamios expandidos mostraron un aumento significativo en el número de vasos sanguíneos formados, y células gigantes multinucleadas en comparación con una estera de nano fibra tradicional.
Después de este procedimiento, diferentes moléculas incluyendo factores de crecimiento, compuestos de amino-modulación, agentes hemostáticos y agentes antimicrotubulares pueden ser incorporados en las esteras de nano fibra y expandidos en fluido de CO2 subcrítico. Estos andamios de nanofibra expandido funcionalizados podrían utilizarse para explorar nuevas preguntas en otros campos científicos, como la hemostasia, la prevención y el tratamiento de infecciones, la inmunología y la regeneración y reparación de tejidos. Los disolventes orgánicos son tóxicos y deben manipularse en una capucha química.
Además, se debe utilizar un recipiente que pueda soportar la alta presión del fluido de CO2 subcrítico para la expansión.
