Este protocolo relatou a transformação de nanofibremembranos eletrofibremsos tradicionais de 2D para 3D, via despressurização do fluido de CO2 subcrático que não foi realizado anteriormente. Este método elimina muitas questões associadas a abordagens anteriores, incluindo o uso de soluções aquosas e reações químicas, processos de múltiplas etapas, perda de atividade de moléculas biológicas encapsuladas e limitações de polímeros hidrofóbicos. Demonstrando este procedimento está Shixuan Chen, um pós-doutor do meu laboratório.
Em um tubo de vidro de 20 mililitre, dissolva dois gramas de PCL em uma mistura de solvente de diclorometano e DMF, com uma proporção de quatro para um a uma concentração de 10%. Coloque o tubo de vidro em um rotador de laboratório até que a solução fique clara. A solução pode se misturar durante a noite.
Para configurar o aparelho de eletropinning, primeiro, adicione a solução PCL a uma seringa de 20 mililitros com uma agulha sem medida de 21. Certifique-se de que não há ar na seringa e tubos dissociados. Coloque um tambor de aço rotativo com o coletor de terra a 12 centímetros da ponta da agulha.
Usando clipes de jacaré, conecte a fonte de alimentação de alta tensão de corrente direta à agulha e certifique-se de que o coletor esteja aterrado. Para os 20 mililitros da solução PCL, defina o parâmetro da bomba de seringa usando um diâmetro de 20,27 milímetros e uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por hora. Verifique se as gotículas estão se formando na ponta da agulha.
Aplique um potencial elétrico de 20 quilovolts entre o spinneret e um coletor de terra localizado a 20 centímetros de distância do spinneret. Colete os tapetes de nanofibra alinhados em um tambor, girando a 2.000 RPM. Colete os tapetes de nanofibra PCL uma vez que atingem uma espessura de aproximadamente um milímetro.
Mergulhe os tapetes de nanofibra PCL em nitrogênio líquido por cinco minutos. Mantenha os tapetes de nanofibra PCL em nitrogênio líquido, e soque tapetes de nanofibra PCL com um soco de 0,5 milímetros de diâmetro. Coloque os tapetes de nanofibra PCL em nitrogênio líquido por cinco minutos.
Corte os tapetes em um centímetro por quadrados de um centímetro usando uma tesoura cirúrgica afiada enquanto submerso em nitrogênio líquido para evitar a deformação das bordas. Coloque o tapete cortado em um tubo de centrífuga de 30 mililitros com aproximadamente um grama de gelo seco. Tampa firmemente a tampa, e permite que o gelo seco se transforme em dióxido de carbono líquido.
Uma vez que o líquido tenha se formado no tubo, solte rapidamente a pressão abrindo a tampa. Retire e observe o andaime inchado do tubo. Coloque o andaime em um novo tubo de centrífuga com gelo seco, e repita a espessura do desejo.
Esterilize os andaimes de nanofibra expandidos em óxido de etileno antes da incubação com células. A eficácia da expansão dos tradicionais tapetes de nanofibra eletrospun 2D em andaimes 3D via despressurização do fluido de CO2 subcrático é mostrada à esquerda após o segundo tratamento. A espessura do andaime aumentou de um milímetro quando não tratado para 2,5 milímetros com um tratamento de CO2, para 19,2 milímetros com dois tratamentos de CO2.
A porosidade dos andaimes aumentou de 79,5% para os tapetes não tratados, para 92,1% após o primeiro tratamento, para 99,0% após o segundo tratamento. Isso é significativo porque o grau de penetração celular em um andaime, e, portanto, sua eficácia para induzir a regeneração, é em grande parte dependente da porosidade. As imagens da SEM revelam que a estrutura fibular densamente embalada de tapetes 2D não tratados foi transformada em estruturas ordenadas e em camadas com nano fibras alinhadas após a expansão com CO2.
Em Vevo os estudos foram realizados por implantação subcutânea de andaimes de nano fibra expandidos de CO2 com buracos quadrados para ratos. Isso permite a migração celular e a proliferação dentro dos buracos, bem como uma infiltração adicional dentro das camadas de nano fibra que foram criadas durante a expansão. Da semana um ao quatro pós-implantação, os andaimes expandidos mostraram um aumento significativo no número de vasos sanguíneos formados, e células gigantes multinucleadas quando comparadas a um tapete tradicional de nano fibra.
Após este procedimento, diferentes moléculas, incluindo fatores de crescimento, compostos amino-moduladores, agentes hemostáticos e agentes anti-microtubulares podem ser incorporados nos tapetes de nano fibra e expandidos em fluido co2 subcrítico. Esses andaimes de nano fibra expandidos funcionalizados poderiam ser usados para explorar novas questões em outros campos científicos, como hemostasia, prevenção e tratamento de infecção, imunologia e regeneração e reparação tecidual. Solventes orgânicos são tóxicos, e devem ser manuseados em uma capa química.
Além disso, um recipiente que possa suportar a alta pressão do fluido de CO2 subcrático deve ser usado para a expansão.
