Dieses Protokoll berichtete über die Umwandlung traditioneller elektrogesponnener Nanofasermembranen von 2D auf 3D durch Druckaufschlagisierung subkritischer CO2-Flüssigkeit, die zuvor nicht realisiert wurde. Diese Methode beseitigt viele Probleme im Zusammenhang mit früheren Ansätzen, einschließlich der Verwendung von wässrigen Lösungen und chemischen Reaktionen, mehrstufige Prozesse, Verlust der Aktivität von verkapselten biologischen Molekülen, und Einschränkungen von hydrophoben Polymeren. Diesem Verfahren wird Shixuan Chen demonstriert, ein Postdoc aus meinem Labor.
In einem 20-Liter-Glasrohr zwei Gramm PCL in einem Lösungsmittelgemisch aus Dichlormethan und DMF auflösen, mit einem Verhältnis von vier zu eins bei einer Konzentration von 10 Prozent. Legen Sie das Glasrohr in einen Laborrotator, bis die Lösung klar wird. Die Lösung kann sich über Nacht mischen.
Um das Elektrospinngerät einzurichten, fügen Sie zunächst die PCL-Lösung zu einer 20-Milliliter-Spritze mit einer 21 Gauge stumpfen Nadel hinzu. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luft in der Spritze befindet und dissoziierte Schläuche. Legen Sie eine rotierende Stahltrommel mit dem Bodenkollektor 12 Zentimeter von der Nadelspitze entfernt.
Schließen Sie die Gleichstrom-Hochspannungsversorgung mit Alligatorclips an die Nadel an und stellen Sie sicher, dass der Kollektor geerdet ist. Legen Sie für die 20 Milliliter PCL-Lösung den Parameter der Spritzenpumpe mit einem Durchmesser von 20,27 Millimetern und einer Durchflussrate von 0,5 Milliliter pro Stunde fest. Prüfen Sie, ob sich die Tröpfchen an der Spitze der Nadel bilden.
Tragen Sie ein elektrisches Potential von 20 Kilovolt zwischen dem Spinneret und einem Bodensammler auf, der sich 20 Zentimeter vom Spinneret entfernt befindet. Sammeln Sie die ausgerichteten Nanofasermatten in einer Trommel, die sich bei 2.000 Umdrehungen pro Minute dreht. Sammeln Sie die PCL-Nanofasermatten, sobald sie eine Dicke von etwa einem Millimeter erreichen.
Tauchen Sie die PCL-Nanofasermatten fünf Minuten lang in flüssigen Stickstoff ein. Bewahren Sie die PCL-Nanofasermatten in flüssigem Stickstoff auf und stanzen Sie PCL-Nanofasermatten mit einem Stempel von 0,5 Millimetern. Legen Sie die PCL-Nanofasermatten fünf Minuten lang in flüssigen Stickstoff.
Schneiden Sie die Matten mit einer scharfen chirurgischen Schere in einen Zentimeter um einen Zentimeter Quadrate, während Sie in flüssigen Stickstoff getaucht werden, um eine Verformung der Kanten zu vermeiden. Legen Sie die geschnittene Matte in ein 30 Milliliter Zentrifugenrohr mit etwa einem Gramm Trockeneis. Den Deckel fest verschließen und das Trockeneis in flüssiges Kohlendioxid verwandeln lassen.
Sobald sich die Flüssigkeit im Rohr gebildet hat, lassen Sie den Druck schnell los, indem Sie die Kappe öffnen. Entfernen und beobachten Sie das aufgeblasene Gerüst aus dem Rohr. Legen Sie das Gerüst in ein neues Zentrifugenrohr mit Trockeneis, und wiederholen Sie die Wunschdicke erreicht wird.
Sterilisieren Sie die expandierten Nanofasergerüste in Ethylenoxid vor der Inkubation mit Zellen. Die Wirksamkeit der Erweiterung traditioneller 2D-Elektrospunten Nanofasermatten zu 3D-Gerüsten durch Druckaufschlag von subkritischer CO2-Flüssigkeit wird auf der linken Seite nach der zweiten Behandlung gezeigt. Die Dicke des Gerüstes stieg bei unbehandelter Behandlung von einem Millimeter auf 2,5 Millimeter bei einer CO2-Behandlung auf 19,2 Millimeter bei zwei CO2-Behandlungen.
Die Porosität der Gerüste stieg von 79,5 Prozent für die unbehandelten Matten auf 92,1 Prozent nach der ersten Behandlung auf 99,0 Prozent nach der zweiten Behandlung. Dies ist wichtig, da der Grad der Zelldurchdringung in ein Gerüst und damit seine Wirksamkeit zur Regeneration weitgehend von der Porosität abhängt. SEM-Bilder zeigen, dass die dicht gepackte fibuläre Struktur unbehandelter 2D-Matten nach der Expansion mit CO2 in geordnete, geschichtete Strukturen mit ausgerichteten Nanofasern umgewandelt wurde.
In Vevo wurden Studien durch subkutane Implantation von CO2-expandierten Nanofasergerüsten mit quadratisch angeordneten Löchern an Ratten durchgeführt. Dies ermöglicht eine zelluläre Migration und Proliferation innerhalb der Löcher sowie eine weitere Infiltration innerhalb der Nanofaserschichten, die während der Expansion entstanden sind. Von Woche eins bis vier nach der Implantation zeigten die erweiterten Gerüste einen signifikanten Anstieg der Anzahl der gebildeten Blutgefäße und multinukleierten Riesenzellen im Vergleich zu einer herkömmlichen Nanofasermatte.
Nach diesem Verfahren können verschiedene Moleküle wie Wachstumsfaktoren, Aminomodulierende Verbindungen, hämostatische Wirkstoffe und antimikrotubuläre Wirkstoffe in die Nanofasermatten integriert und in subkritischer CO2-Flüssigkeit erweitert werden. Solche funktionalisierten erweiterten Nanofasergerüste könnten verwendet werden, um neue Fragen in anderen wissenschaftlichen Bereichen zu erforschen, wie Hämostase, Prävention und Behandlung von Infektionen, Immunologie und Geweberegeneration und -reparatur. Organische Lösungsmittel sind giftig und sollten in einer chemischen Haube behandelt werden.
Darüber hinaus sollte ein Behälter, der den hohen Druck von subkritischer CO2-Flüssigkeit aushalten kann, für die Expansion verwendet werden.
