これらの技術の成功した適用は、薬理学的試験の運動学的評価または形態学的に無傷の胎盤を介した異種生物汚染物質の通過を可能にする。げっ歯類の胎盤灌流技術は、複数の化合物が単一のダムの組織を使用して評価され得るように、薬理学的または毒物学的研究のより高いスループットを可能にする。この技術のデモンストレーションは、私の研究室の上級大学院生であるジャニーン・デリコです。
手順を開始する前に、チャンバー、針、ガラスマイクロピペット、チューブ、貯留層を温めた生理学的塩溶液またはPSSで静かに満たし、必要に応じて細かいチップトランスファーピペットで気泡を慎重に除去します。ピペット内の流体を固定するためにオフの位置に3ウェイストップコックのすべてを回します。子宮内缶取用に用意された2つのガラスマイクロピペットと、臍のカヌレーション用に指定された2つの鈍い先端針のそれぞれに1つのネクタイを置きます。
その後、チャンバーの動きの間に損失を防ぐために、ネクタイを確保します。麻酔妊娠20日目の雌の妊娠ラットでつま先ピンチへの応答の欠如を確認した後、腹部から1つの子宮角を持ち上げ、動物の外に長く角を広げる。編み込みシルク縫合糸を使用して、子宮ホーンで縫合糸の内側の卵巣を含む角の膣と卵巣の端部の子宮動脈を結び付けます。
手術用ハサミを使用して、卵巣のネクタイの近位側と膣のネクタイの遠位側に切開を行います。子宮ホーンをシリコーンゴムが並び、冷たいPSSで満たされた解剖皿に移します。卵巣側を左側に、膣側を右側に、子宮の角を通して解剖ピンをシリコンゴムにそっと押し込み、子宮を安定させます。
角の中心にある母体胎盤胎児単位を選択します。細かい鉗子とはさみを使用して、臍帯を避けるために注意を払って胎盤の胎児表面から羊膜を取り除きます。胎児の子犬を分離するために臍帯を解き明かし、リゲートします。
臍動脈と静脈を同定した後、臍帯を穏やかに分離し、リゲートする。その後、臍帯静脈を臍動脈よりもわずかに短く切断し、同定を容易にする。そして、外科的はさみで子宮動脈と静脈をリゲートします。
子宮動脈解剖血流の正しい配向を維持し、胎盤ユニットを解剖顕微鏡下で温かい酸素化PSSで満たされた改変された単離された容器室に入れる。各手に1組の細かい鉗子を使用して、子宮動脈の近位および遠位端をガラスマイクロピペットにカニュールします。以前に設置された無菌ナイロン縫合糸で動脈をしっかりと固定します。
23ゲージの鈍い針に臍動脈をカニューレートし、固定する。その後、25ゲージの鈍い針に臍帯静脈をカニューレにして固定し、すべてのストップコックとチューブを埋め戻して気泡を防ぎます。システム内の空気ボーラスは細胞の苦痛につながり、胎盤内のカウンター電流の流れを排除するので、気泡のためのストップコック、カニューラ、チューブのすべてをチェックすることを忘れないでください。
図に従ってすべてのチューブを接続します。小さな計量ボートを母体の子宮動脈の遠位のカンヌリンの下に置き、胎児臍帯静脈の針の缶詰の下に置き、処置の過程で出現する排水を捕まえる。後で分析するために排水のために回収プレートを準備します。
ストップコックを開いて、胎盤に向かってチューブを通して流体の流れを可能にし、蠕動ポンプ、圧力制御および圧力モニタをオンにします。圧力計で読み取った80ミリメートルの水銀にゆっくりと圧力を上げます。ゆっくりと、子宮動脈への流体の流れを可能にするために栓コックを開きます.
すべての貯蔵所を補充して、実験全体を通して流体量を維持します。組織が30分間平衡化して脈管が新しい流体の流れに適応できるようにした後、両方の計量艇から10分間排水を集めることによってベースライン灌流を確立する。子宮動脈と臍静脈を介して出現する流体の量を測定します。
ベースライン採取期間の終わりに、実験処置を子宮動脈に投与する。次に、遠位子宮動脈および胎児臍帯静脈の流出から、注入後の合計180分間、10分ごとにサンプルを採取する。流体サンプル内の汚染物質を測定します。
エバンスブルー色素を使用した灌流は、システムをテストし、胎児コンパートメントへの汚染物質の伝達を防止するための適切な流体および胎盤バリア機能を可視化するために、この系内の胎盤組織に色素が到達し、浸透していることを明らかにする。より詳しい調査の結果、エバンスブルー染料はアルブミンに結合しているので、エバンスブルー染料が胎児臍帯静脈に入らなかったことは明らかです。本代表的実験では、ポリスチレン注入の10分以内に胎児区画への減少した流体移動が同定された。
その後、胎児コンパートメントへのポリスチレン移管は20分でピークに達し、90分間続いた。缶取の間に覚えておかなければならない最も重要なことは、ゆっくりと行くことだ。ピペットと組織は非常に繊細で、簡単に壊れたり引き裂かれたりすることができます。
この方法論は、胎盤の生理学と物質的転位を調べるのに使用できます。
