部位特異的変異生成は、RNA-RNA、RNAタンパク質相互作用などの分子相互作用を研究するのに有用です。このプロトコルは、2つまたは3段階のPCRアプローチでサイト指向変異誘発を行う方法を説明します。この方法の主な利点は、組み込むことができる異なる突然変異の多様性と、それを行うための相対的な容易さとコストです。
まず、野生型DNAテンプレートとプライマーペア2、1、2、3、またはプライマーペア3、1、および3、4、PCR産物1を得るために使用します。アガロースゲル電気泳動によるPCR産物を検証するには、電子レンジを使用して1X TAEバッファーの100ミリリットルに2グラムのアガロースを溶解して2%アガロースゲルを作ります。1ミリリットル当たり0.5マイクログラムの最終濃度で臭化エチジウムを添加します。
その後、アガロースゲルをキャストします。固化したら、電気泳動ユニットに入れる。既知のサイズのDNAラダーをロードし、PCRサンプルをDNAローディング染料と混合して井戸に積み込みます。
75ボルトでサンプルを45分間実行します。また、UVトランイルミエータまたはゲルイメージングシステムでバンドを可視化します。次に、メーカーのプロトコルに従ってゲル抽出キットでPCR製品を精製し、分光光度計で精製されたDNAの濃度を測定します。
次に、精製したDNAをマイナス20°CでTEバッファーに保存します。2ステップPCRで部位特異的変異を開始するには、まず野生型DNAテンプレートを使用し、次にプライマーペア2、1および2、2、5プライマー突然変異、またはプライマーペア2、2、および2のプライマーペアを使用して、3つのプライマー突然変異に対してPCR産物2を得る。ゲル電気泳動によりPCR産物を検証し、PCR産物を精製し、前述のとおり濃度を測定します。
次いで、野生型DNA鋳型とPCR産物2をプライマーとして使用し、プライマー2と共に、5つのプライマー突然変異に対して3つ、またはプライマー2、3つのプライマー突然変異に対して1つ、PCR産物3を得る。ゲル電気泳動によりPCR産物を検証し、PCR産物を精製し、前述のとおり濃度を測定します。次に、精製したDNAをマイナス20°CでTEバッファーに保存します。
3ステップPCRで部位特異的突然変異誘発を開始するには、まず野生型DNAテンプレートとプライマーペア3、1、および3、2を使用してPCR産物2を得ます。野生型DNAテンプレートとプライマーの組を3、3、および3、4を使用して、PCR産物3を得る。野生型DNAテンプレートとプライマーの組を3、3、4、4で、PCR産物3を得る。
ゲル電気泳動によりPCR産物を検証し、PCR産物を精製し、前述のとおり濃度を測定します。最後に、2~5ナノグラムのPCR産物をテンプレートとして用い、プライマーペア3、1、3、4を用いてPCR製品4を得る。ゲル電気泳動によりPCR産物を検証し、PCR産物を精製し、前述のとおり濃度を測定します。
精製したDNAをマイナス20°CでTEバッファーに保存します。本研究では、CsgDの転写後調節に関するRNA相互作用を調べるには、2段階および3段階の部位特異的変異誘発を用いた。野生型のCsgDをPCR増幅してPCR産物IAを生成し、野生型mcaSをPCR増幅してPCR産物IBを生成した。3段階PCR戦略を用いて、最初の2つのステップでPCR産物IIAとIIIAを合成し、第3ステップではIVAをCsgDに変異を導入した。
同様に、MCASでは、最初の2つのステップでIIB、IIIB、および3番目のステップでIVBを得るために、無料の部位指向突然変異が導入されました。ウェスタンブロット分析は、野生型mcaSの発現は野生型CsgDの翻訳を妨げるが、mcaSまたはCsgDのいずれかの突然変異が観察された抑圧を緩和することを示した。しかし、CsgDとmcaSの両方の突然変異は、CsgDの翻訳を妨げる。
2ステップPCR戦略を用いて、PCR産物IIC、IID、IIE、IIF、およびIIGを第1ステップで合成し、第2ステップでは、CSgD DNA全体に変異を導入する第2のステップで、IIIC、IIID、IIIE、IIIF、およびIIIGをPCR産物としました。インビトロに転写されたCSgD野生型および変異型RNAへのHFQ結合のEMSAの結果は、PCR産物IIIC、IIID、IIIE、IIIF、およびIIIGを用いて合成し、変異型対立遺伝子のKD値の増加を示した。これは、HFQが突然変異体にあまり効率的に結合できることを証明した。
さらにHFQは、CsgD上にいくつかの結合部位を有し、これは野生型RNAについて観察された3つのシフトによって示される。しかし、異なる変異型RNAに対して観察されるのは2つの結合部位のみである。したがって、サイト指向の突然変異アプローチは、HFQの完全結合に重要なCsgD mRNAの一次および二次構造を特定する。
ここで説明する部位特異的突然変異誘発法はPCRに依存する。適切な PCR プラクティスは、この方法にとって非常に重要であり、最適化を成功させるために必要な場合があります。部位特異的突然変異誘発は、EMSAおよびウェスタンブロッティングのような3つの方法すべてにおいてのみ強力である。
他の方法としては、例えば、種々の構造アッセイおよびいくつかの活性アッセイ、および翻訳後修飾研究が含まれる。
