La mutagenèse dirigée par le site est utile pour étudier les interactions moléculaires, telles que l’ARN-ARN et les interactions arn-protéine. Ce protocole décrit comment effectuer la mutagenèse dirigée par le site avec une approche PCR en deux ou trois étapes. Les principaux avantages de la méthode sont la diversité des différentes mutations qui peuvent être incorporées, ainsi qu’une facilité relative et le coût pour le faire.
Pour commencer, utilisez le modèle d’ADN de type sauvage et les paires d’amorce deux, une et deux, trois, spécifiques pour les paires de deux étapes, ou d’amorce trois, une et trois, quatre, spécifiques pour pcr en trois étapes pour obtenir le produit PCR un. Pour valider les produits PCR par électrophoresis gel agarose, faire un gel agarose de 2% en dissolvant deux grammes d’agarose en 100 millilitres de tampon 1X TAE, à l’aide d’un four à micro-ondes. Ajouter le bromure d’éthidium à une concentration finale de 0,5 microgramme par millilitre.
Puis jetez le gel agarose. Une fois solidifié, placez-le dans une unité d’électrophorèse. Chargez une échelle d’ADN de taille connue, et les échantillons de PCR mélangés avec du colorant de chargement d’ADN dans les puits.
Faire fonctionner les échantillons à 75 volts pendant 45 minutes. Et visualisez les bandes sur un transilluminateur UV ou avec un système d’imagerie par gel. Ensuite, purifier le produit PCR avec un kit d’extraction de gel selon le protocole des fabricants et mesurer la concentration de l’ADN purifié avec un spectrophotomètre.
Ensuite, stockez l’ADN purifié à moins 20 degrés Celsius dans le tampon TE. Pour commencer la mutagenèse dirigée par le site avec un PCR en deux étapes, utilisez d’abord le modèle d’ADN de type sauvage, puis l’amorce paires deux, un et deux, deux, pour cinq mutations d’amorce, ou paires d’amorce deux, deux, et deux, trois pour trois mutations d’amorce pour obtenir le produit PCR deux. Valider le produit PCR par électrophorèse gel, purifier le produit PCR, et mesurer sa concentration comme décrit précédemment.
Ensuite, utilisez le modèle d’ADN de type sauvage et le produit PCR deux comme amorce, avec l’amorce deux, trois pour cinq mutations d’amorce, ou l’amorce deux, un pour trois mutation d’amorce, pour obtenir le produit PCR trois. Valider le produit PCR par électrophorèse gel, purifier le produit PCR, et mesurer sa concentration comme décrit précédemment. Ensuite, stockez l’ADN purifié à moins 20 degrés Celsius dans le tampon TE.
Pour commencer la mutagenèse directe du site avec un PCR en trois étapes, utilisez d’abord le modèle d’ADN de type sauvage et les paires d’amorce trois, un et trois, deux pour obtenir le produit PCR deux. Utilisez le modèle d’ADN de type sauvage et les paires d’amorce trois, trois et trois, quatre, pour obtenir le produit PCR trois. Utilisez le modèle d’ADN de type sauvage et les paires d’amorce trois, trois et trois, quatre, pour obtenir le produit PCR trois.
Valider le produit PCR par électrophorèse gel, purifier le produit PCR, et mesurer sa concentration comme décrit précédemment. Enfin utiliser deux à cinq nanogrammes de produits PCR deux et trois comme modèle avec des paires d’amorce trois, un et trois, quatre, pour obtenir le produit PCR quatre. Valider le produit PCR par électrophorèse gel, purifier le produit PCR, et mesurer sa concentration comme décrit précédemment.
Conservez l’ADN purifié à moins 20 degrés Celsius dans le tampon TE. Dans cette étude, la mutagenèse de site en 2 étapes et en 3 étapes a été employée pour étudier des interactions d’ARN concernant la régulation post transcriptionnelle de CsgD. Le CsgD sauvage-type a été PCR amplifié pour produire le produit de PCR IA, et le mcaS sauvage-type a été PCR amplifié pour produire le produit de PCR IB. À l’aide d’une stratégie PCR en trois étapes, les produits PCR IIA et IIIA ont été synthétisés dans les deux premières étapes, et l’IVA dans la troisième étape pour introduire des mutations dans csgd.
De même, des mutations complémentaires dirigées par le site ont été introduites dans mcaS pour produire des produits PCR IIB, IIIB, dans les deux premières étapes, et IVB dans la troisième étape. L’analyse occidentale de tache a prouvé que tandis que l’expression du mcaS sauvage-type empêche la traduction du CsgD sauvage-type, les mutations dans mcaS ou CsgD soulage la répression observée. Cependant, les mutations dans csgd et mcaS empêchent la traduction de CsgD.
À l’aide d’une stratégie PCR en deux étapes, les produits PCR IIC, IID, IIE, IIF et IIG ont été synthétisés dans la première étape, et les produits PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF et IIIG, dans la deuxième étape pour introduire des mutations à l’ensemble de l’ADN csgd. Les résultats de l’EMSA de la liaison HFQ aux ARN sauvages et mutants transcrits in vitro csgd, synthétisés à l’aide des produits PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF et IIIG, ont montré l’augmentation des valeurs KD des allèles mutants. Cela a prouvé que HFQ pouvait se lier moins efficacement aux mutants.
En outre HFQ a plusieurs sites contraignants sur csgd, qui est montré par les trois décalages observés pour l’ARN de type sauvage. Cependant, seulement deux sites contraignants sont observés pour différents ARN mutants. Ainsi, l’approche mutationnelle dirigée par le site identifie les structures primaires et secondaires de l’ARNm CsgD qui sont importantes pour la liaison complète de HFQ.
La méthode de mutagenèse dirigée par le site décrite ici repose sur pcr. De bonnes pratiques pcr sont donc cruciales pour la méthode et pourraient nécessiter une optimisation réussie. La mutagenèse dirigée par le site n’est puissante qu’avec les trois méthodes telles que l’EMSA et le Blotting occidental.
D’autres méthodes, par exemple, incluent divers analyses structurelles et quelques analyses d’activité, et des études de modification post-traduction.
