Mutagênese dirigida ao local é útil para estudar interações moleculares, como RNA-RNA e interações proteicas de RNA. Este protocolo descreve como executar mutagênese direcionada ao site com uma abordagem PCR de duas ou três etapas. As principais vantagens do método são a diversidade de diferentes mutações que podem ser incorporadas, bem como uma relativa facilidade e custo para fazê-lo.
Para começar, use o modelo de DNA do tipo selvagem e os pares de primer dois, um e dois, três, específicos para pares de 2 etapas, ou primer três, um e três, quatro, específicos para PCR de 3 passos para obter um produto PCR. Para validar os produtos PCR por eletroforese de gel agarose, faça um gel de 2% de agarose dissolvendo dois gramas de agarose em 100 mililitros de tampão TAE 1X, usando um forno de micro-ondas. Adicione brometo de etídio a uma concentração final de 0,5 microgramas por mililitro.
Em seguida, lançar o gel agarose. Quando solidificado, coloque-o em uma unidade de eletroforese. Carregue uma escada de DNA de tamanho conhecido, e as amostras de PCR misturadas com DNA carregando corante em poços.
Execute amostras a 75 volts por 45 minutos. E visualize bandas em um transilluminator UV ou com um sistema de imagem em gel. Em seguida, purifique o produto PCR com um kit de extração de gel de acordo com o protocolo dos fabricantes e meça a concentração do DNA purificado com um espectotômetro.
Em seguida, armazene o DNA purificado a menos 20 celsius no buffer TE. Para iniciar mutagênese direcionada ao local com um PCR de 2 passos, primeiro use o modelo de DNA do tipo selvagem, depois o primer emparelha dois, um e dois, dois, para cinco mutações de primer, ou pares de primer dois, dois e dois, três para três mutações priment para obter o produto PCR dois. Valide o produto PCR por eletroforese de gel, purificar o produto PCR e medir sua concentração como descrito anteriormente.
Em seguida, use o modelo de DNA tipo selvagem e o produto PCR dois como o primer, juntamente com primer dois, três para cinco mutação priment, ou primer dois, um para três mutação priment, para obter o produto PCR três. Valide o produto PCR por eletroforese de gel, purificar o produto PCR e medir sua concentração como descrito anteriormente. Em seguida, armazene o DNA purificado a menos 20 graus celsius no buffer TE.
Para iniciar a mutagênese direta do local com um PCR de 3 passos, primeiro use o modelo de DNA do tipo selvagem e os pares de primer três, um e três, dois para obter o produto PCR dois. Use o modelo de DNA do tipo selvagem e os pares de primer três, três e três, quatro, para obter o produto PCR três. Use o modelo de DNA do tipo selvagem e os pares de primer três, três e três, quatro, para obter o produto PCR três.
Valide o produto PCR por eletroforese de gel, purificar o produto PCR e medir sua concentração como descrito anteriormente. Por fim, use dois a cinco nanogramas de produtos PCR dois e três como modelo, juntamente com os pares de primer três, um e três, quatro, para obter o produto PCR quatro. Valide o produto PCR por eletroforese de gel, purificar o produto PCR e medir sua concentração como descrito anteriormente.
Armazene o DNA purificado a menos 20 graus celsius no buffer TE. Neste estudo, foram utilizadas mutagênese direcionadas a 2 passos e 3 etapas para investigar as interações de RNA relativas à regulação pós-transcricional do CsgD. O CsgD do tipo selvagem foi amplificado para produzir IA do produto PCR, e o mcaS do tipo selvagem foi amplificado para produzir o produto PCR IB. Utilizando uma estratégia pcr de 3 passos, os produtos PCR IIA e IIIA foram sintetizados nos dois primeiros passos, e o IVA na terceira etapa para introduzir mutações em CsgD.
Da mesma forma, mutações gratuitas direcionadas ao local foram introduzidas no MCAS para produzir produtos PCR IIB, IIIB, nas duas primeiras etapas, e IVB na terceira etapa. A análise de manchas ocidentais mostrou que, enquanto a expressão de mcaS tipo selvagem impede a tradução de CsgD tipo selvagem, mutações em mcaS ou CsgD aliviam a repressão observada. No entanto, mutações tanto no CsgD quanto no MCAS impedem a tradução de CsgD.
Utilizando uma estratégia pcr de 2 passos, os produtos PCR IIC, IID, IIE, IIF e IIG, foram sintetizados na primeira etapa, e os produtos PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF e IIIG, no segundo passo para introduzir mutações em todo o DNA CsgD. Os resultados da EMSA da vinculação HFQ a RNAs de tipo selvagem e mutante transcritos in vitro, sintetizados usando produtos PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF e IIIG, mostraram o aumento dos valores de KD dos alelos mutantes. Isso provou que o HFQ poderia ligar-se menos eficientemente aos mutantes.
Além disso, o HFQ possui vários locais de vinculação em CsgD, o que é mostrado pelos três turnos observados para o RNA do tipo selvagem. No entanto, apenas dois locais de ligação são observados para diferentes RNAs mutantes. Assim, a abordagem mutacional dirigida ao local identifica estruturas primárias e ou secundárias do MRNA CsgD que são importantes para a ligação completa do HFQ.
O método para mutagênese direcionado ao local descrito aqui depende do PCR. Boas práticas de PCR são cruciais para o método e podem exigir otimização para ser bem sucedida. Mutagênese dirigida ao local só é poderosa com todos os três métodos como EMSA e Western Blotting.
Outros métodos, por exemplo, incluem vários ensaios estruturais e alguns ensaios de atividade, e estudos de modificação de pós-tradução.
