La mutagenesi site-directed è utile per studiare le interazioni molecolari, come l'RNA-RNA e le interazioni con le proteine dell'RNA. Questo protocollo descrive come eseguire la mutagenesi diretta dal sito con un approccio PCR in due o 3 step. I principali vantaggi del metodo sono la diversità delle diverse mutazioni che possono essere incorporate, nonché una relativa facilità e costo per farlo.
Per iniziare, usa il modello di DNA di tipo selvatico e le coppie primer due, una e due, tre, specifiche per coppie di 2 step o primer tre, una e tre, quattro, specifiche per PCR in 3 step per ottenere il prodotto PCR uno. Per convalidare i prodotti PCR mediante elettroforesi in gel di agarosio, creare un gel di agarosio al 2% sciogliendo due grammi di agarosio in 100 millilitri di tampone TAE 1X, utilizzando un forno a microonde. Aggiungere bromuro di etidio ad una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per millilitro.
Quindi gettare il gel di agarosio. Una volta solidificato, posizionarlo in un'unità di elettroforesi. Caricare una scala del DNA di dimensioni note e i campioni di PCR mescolati con colorante per il caricamento del DNA in pozzi.
Eseguire campioni a 75 volt per 45 minuti. E visualizzare le bande su un transilluminatore UV o con un sistema di imaging in gel. Successivamente, purificare il prodotto PCR con un kit di estrazione del gel secondo il protocollo dei produttori e misurare la concentrazione del DNA purificato con uno spettrofotometro.
Quindi conservare il DNA purificato a meno 20 celsius nel tampone TE. Per iniziare la mutagenesi diretta dal sito con una PCR in 2 passi, utilizzare prima il modello di DNA di tipo selvaggio, quindi il primer accoppia due, uno e due, due, per cinque mutazioni primer, o primer coppie due, due e due, tre per tre mutazioni primenti per ottenere il prodotto PCR due. Convalidare il prodotto PCR per elettroforesi in gel, purificare il prodotto PCR e misurarne la concentrazione come descritto in precedenza.
Quindi usa il modello di DNA di tipo selvaggio e il prodotto PCR due come primer, insieme a primer due, tre per cinque mutazioni primenti, o primer due, uno per tre mutazioni primenti, per ottenere il prodotto PCR tre. Convalidare il prodotto PCR per elettroforesi in gel, purificare il prodotto PCR e misurarne la concentrazione come descritto in precedenza. Quindi conservare il DNA purificato a meno 20 gradi Celsius nel tampone TE.
Per iniziare la mutagenesi diretta del sito con una PCR in 3 step, utilizzare prima il modello di DNA di tipo selvaggio e primer coppie tre, uno e tre, due per ottenere il prodotto PCR due. Utilizzare il modello di DNA di tipo selvatico e le coppie primer tre, tre e tre, quattro, per ottenere il prodotto PCR tre. Utilizzare il modello di DNA di tipo selvaggio e primer coppie tre, tre e tre, quattro, per ottenere il prodotto PCR tre.
Convalidare il prodotto PCR per elettroforesi in gel, purificare il prodotto PCR e misurarne la concentrazione come descritto in precedenza. Infine utilizzare da due a cinque nanogrammi di prodotti PCR due e tre come modello insieme alle coppie primer tre, una e tre, quattro, per ottenere il prodotto PCR quattro. Convalidare il prodotto PCR per elettroforesi in gel, purificare il prodotto PCR e misurarne la concentrazione come descritto in precedenza.
Conservare il DNA purificato a meno 20 gradi Celsius nel tampone TE. In questo studio, la mutagenesi diretta dal sito in 2 e 3 step è stata utilizzata per indagare le interazioni dell'RNA riguardo alla regolazione post trascrizionale del CsgD. Il CsgD di tipo selvaggio è stato amplificato pcr per produrre IA prodotto PCR, e il mcaS di tipo selvaggio è stato amplificato pcr per produrre prodotto PCR IB. Utilizzando una strategia PCR in 3 fasi, i prodotti PCR IIA e IIIA sono stati sintetizzati nei primi due passaggi e IVA nella terza fase per introdurre mutazioni in CsgD.
Allo stesso modo, mutazioni gratuite dirette dal sito sono state introdotte in mcaS per produrre prodotti PCR IIB, IIIB, nei primi due passaggi, e IVB nel terzo passaggio. L'analisi western blot ha mostrato che mentre l'espressione di mcaS di tipo selvatico impedisce la traduzione di CsgD di tipo selvaggio, mutazioni in mcaS o CsgD alleviano la repressione osservata. Tuttavia, le mutazioni sia in CsgD che in mcaS impediscono la traduzione di CsgD.
Utilizzando una strategia PCR in 2 step, i prodotti PCR IIC, IID, IIE, IIF e IIG, sono stati sintetizzati nel primo passaggio e i prodotti PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF e IIIG, nella seconda fase per introdurre mutazioni all'intero DNA CsgD. I risultati dell'EMSA del legame HFQ con gli RNA di tipo selvatico e mutante csgD trascritti in vitro, sintetizzati utilizzando prodotti PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF e IIIG, hanno mostrato l'aumento dei valori KD degli alleli mutanti. Ciò dimostrò che il quartier generale poteva legarsi in modo meno efficiente ai mutanti.
Inoltre hfq ha diversi siti di legame su CsgD, che è mostrato dai tre turni osservati per l'RNA di tipo selvaggio. Tuttavia, solo due siti di legame sono osservati per diversi RNA mutanti. Quindi l'approccio mutazionale diretto al sito identifica le strutture primarie e o secondarie dell'mRNA CsgD che sono importanti per il completo legame del quartier generale.
Il metodo per la mutagenesi diretta dal sito qui descritto si basa sulla PCR. Buone pratiche pcr sono quindi cruciali per il metodo e potrebbero richiedere l'ottimizzazione per avere successo. La mutagenesi diretta dal sito è potente solo con tutti e tre i metodi come EMSA e Western Blotting.
Altri metodi, ad esempio, includono vari saggi strutturali e alcuni saggi di attività, e studi di modifica post-traduzione.
